腰椎软骨终板退变机理的实验研究

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1、第一军医大学博士学位论文腰椎软骨终板退变机理的实验研究姓名：刘斌申请学位级别：博士专业：外科学（骨科）指导教师：金大地20040515中英文缩略词对照表英文缩写英文全称中文全称CEPNoSNPIL．1BIL一6TNF一ⅡTGF—BIGF—IEDTAPBSMMTFBSDEPCSABCulmlrmpUbpdH，oCartilageendplate软骨终板Nitricoxide一氧化氮Sodiumnitropmsside硝普钠Interleukin一1beta白细胞介素．1BInterleukin一6白细胞介素．6Tumornecrosisfactor-alpha肿瘤坏死因子一qTransfor

2、minggrowthfactor—betal转化生长因子．B1Insulin-likegrowthfactor-I胰岛素样生长因子IEthylenedianfinetelxaaceticacid乙二胺四乙酸二钠disodiumPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液3(4，5dimethythiazol一2y1)一2，5-dip噻唑蓝henytrazoliumBromideFetalbovineserlln2胎牛血清Diethylpyrocarbonate焦磷酸二己脂Streptavidin-biofin链霉素亲和素．生物素复complex合物Microliter微升Mi

3、lliliter毫升Rotatespeedpermin每分钟转速Unit单位Basepairs碱基对Deionizedwater去离子水英文缩写英文全称中文全称2腰椎软骨终板退变机理的实验研究中文摘要研究背景：椎间盘退行性病变常可导致原发性下腰痛、颈腰神经根病等多种临床综合征，临床上椎间盘退行性疾病十分常见，严重影响了人们的健康。虽然目前对椎间盘退变的病因尚不完全了解，但系列研究证实，软骨终板是椎间盘的重要营养途径，椎间盘退变与软骨终板退变密切相关，软骨终板退变可能是导致椎间盘退变的一种主要因素。而目前对软骨终板退变研究多局限于形态学等方面，对其发病机理的研究甚少。目前研究发现，炎性细胞因

4、子、NO和细胞凋亡等因素在椎间盘退变及关节软骨退变过程中发挥重要促进作用，而一些生长因子如TGF一13l、IGF—I等可以拮抗IL．113、IL．6、TNF．Ⅱ等炎性细胞因子、NO和细胞凋亡对关节软骨的破坏作用。由于软骨终板结构组成和生化特性与关节软骨相似，因此推断，这几种因素在软骨终板退变中同样发挥着重要作用。通过研究以上各种因素在软骨终板退变中的作用，探讨它们之间作用的相互关系，明确软骨终板退变的启动因素及主要因素，并通过应用生长因子，试图延缓和阻止软骨终板退变的过程，为椎问盘退变的治疗提供新的思路和途径。目的：、(1)通过造成兔腰椎椎间失稳，诱导软骨终板退变发生，探讨软骨终板组织结构

5、及生化组成方面的变化。(2)通过体外培养软骨终板细胞，探讨不同因素对软骨终板细胞的作用，以明确定各种因素相互作用的关系。(3)对软骨终板及细胞施加生长因子，探讨生长因子延缓和阻止软骨终板退变的作用。方法：(1)选用新西兰白兔36只，随机分为手术组18只，对照组18只。手术组沿Ll—L7棘突做后正中切口，剥离椎旁肌，切除Ll～L7的棘上、棘间韧带及两侧关节突关节后外1／2；对照组仅切开皮肤后缝合。于术后12w、24w和36w进行腰椎x线检查、扫描电镜观察、组织学观察、NO含量和NOS活性检测、IL．1B、IL．6、TNF．cL含量检测、蛋白多糖含量及胶原释放量的测定。(2)长枫杂交猪8只，进

6、行软骨终板细胞原代培养，通过MTT比色法绘制细胞生长曲线，通过HE染色、甲苯胺蓝染色、番红O染色及II型胶原免疫细胞化学染色对软骨终板细胞进行鉴定；并分别应用硝普钠刺激软骨终板细胞，放射免疫法检测IL—lB、IL．6、TNF一Ⅱ含量；PI、AO荧光染色法及DNA片段凝胶电泳法检测细胞凋亡；硝酸还原法检测NO含量；”s掺入法检测蛋白多糖合成；3H．脯氨酸掺入法检测胶原合成。(31按不同时间段，将上述实验动物处死取材，进行组织培养，在施加上述因素同时施加TGF一0l、IGF—I、TGF—B1+IGF．I处理；并对软骨终板细胞亦在施加上述因素同时进行TGF—Bl、IGF—I处理。进行No含量和N

7、OS活性检测，IL一1B、IL一6、TNF．0【含量测定，细胞凋亡检测，蛋白多糖含量及胶原释放量的测定。结果：(1)随时间延长，实验组软骨终板与对照组相比钙化严重，胶原纤维排列无规则、纤维变细、断裂，蛋白多糖丢失明显；软骨终板变薄，潮标前移明显，血管芽周围钙化，血管芽数量减少；NO含量和NOS活性升高明显；IL．16、IL．6、TNF．u含量亦随时间延长而增加，而蛋白多糖含量及胶原释放量则显著降低。(2)软骨终板细胞经过