SNT2865-2011尼帕病毒病检疫技术规范.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８６５—２０１１尼帕病毒病检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犖犻狆犪犺狏犻狉狌狊犱犻狊犲犪狊犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《陆生动物诊断试验与疫苗标准手册》（２００４版）２．１０．１０条“亨得拉和尼帕病毒病”。本标准

2、由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、岳志芹、肖西志、邓明俊、谭乐义、辛学谦。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１尼帕病毒病检疫技术规范１范围本标准规定了尼帕病毒病的病毒分离鉴定、电镜观察、免疫组织化学试验、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验等检疫方法。本标准适用于进出境动物尼帕病毒病的检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引

3、用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３概述３．１尼帕病毒（Ｎｉｐａｈｖｉｒｕｓ，ＮｉＶ）病是一种新出现的人畜共患传染病。尼帕病毒病的病原是副黏病毒科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）成员，能够感染人、猪等多种动物。在猪群内传播迅速，症状却不明显，在人群中有人传人的可能，并且人感染ＮｉＶ之后，死亡率高达４０％～７０％。３．２ＮｉＶ可以感染各个年龄段的猪，不同类别的猪表现出不同的临床症状，例如母猪首先表现为神经

4、症状，而肉用猪表现为呼吸道症状，此外，圈养的母猪和公猪活动受到限制，可能掩盖其呼吸道症状。３．３人、猫、狗和马也可以感染ＮｉＶ。人感染ＮｉＶ后，多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主，死亡率很高；狗感染ＮｉＶ后，可出现类似犬瘟热症状；猫感染ＮｉＶ后，死亡率很高；马感染ＮｉＶ后可以出现神经症状，但是死亡率似乎较低。所以在临床诊断时，应注意感染的猪场及其周围人和其他动物的发病情况，注意发病猪场新近是否引进新猪。因尼帕病毒病是可感染人和多种动物的人畜共患传染病，所以处理带有或可能带有此活病毒的样品必须在ＢＳＬ４生物安全

5、实验室内操作。３．４死后剖检发现ＮｉＶ感染猪没有特征性病变，肺和脑膜是主要的病变器官。大多数病例表现由轻微到严重的肺部病变，包括程度不同的实变、气肿、淤血性溢血以及呼吸道有带血丝的分泌物，切开肺部，可见肺小叶间隔肿胀。脑膜弥漫性充血、水肿，其他的内脏器官没有明显的变化。４病毒分离鉴定４．１试剂、材料与仪器４．１．１试剂与材料：Ｖｅｒｏ细胞或ＲＫ１３细胞、ＥＭＥＭ或其他培养基、抗生素贮存液、细胞消化液、细胞培养液和细胞维持液、细胞瓶和各种常规试剂等（见附录Ａ）。试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。４．１．２仪器：生物

6、安全柜或超净工作台、倒置显微镜、高速冷冻离心机、二氧化碳培养箱、高压灭菌锅等。４．２样品采集与处理４．２．１样品采集与运送：无菌采集动物脑、肺、肾和脾脏等组织，４℃保存运送到ＢＳＬ４级生物安全实１标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１验。也可用干冰保存运送，但病料不能长期存放在－２０℃。４．２．２样品处理：无菌处理样品，样品称量，置于无菌密闭容器内，加入少量组织培养液和抗菌素，用无菌研槌研磨，制备成组织悬液。再加组织培养液，使最终为１０％组织悬液。以１５０

7、０ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，小心收取上清液低温保存备用。４．３病毒分离４．３．１将上述上清液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的Ｖｅｒｏ或ＲＫ１３细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液做细胞对照，用６０倍稀释的标准病毒接种做阳性对照。４．３．２加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层，置于３７℃孵育１ｈ。加入维持液置于３７℃继续培养，逐日观察细胞病变（ＣＰＥ），尼帕病毒（ＮｉＶ）一般在３ｄ内出现ＣＰＥ。４．３．３无ＣＰＥ出现者应盲传两代，即将细胞培养物冻融两次，再

8、接种到单层细胞培养５ｄ～７ｄ。出现ＣＰＥ者，待７０％细胞出现ＣＰＥ时，收取细胞毒。将感染细胞反复冻融数次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，小心收集上清液，分装后低温保存，待进一步进行病毒鉴定。４．３．４用微量血清中和试验或其他方法对分离的病毒进行鉴定。４．４结果判定检查各种对照试验，细胞对照正常，无ＣＰＥ；阳性对照出现明显的ＣＰＥ，说明试验成