SNT2708-2010猪圆环病毒病检疫技术规范.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!"!#!"#$"!#%#猪圆环病毒病检疫技术规范$%&'&()*(+,'-)-.-/0-',-'.*(+.*'.-1*'%23*2+&2+!#%#4%%4#%发布!#%%4#&4#%实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７０８—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民

2、共和国上海出入境检验检疫局、广东省农业科学院兽医研究所。本标准主要起草人：朱道中、刘中勇、刘俊平、宋长绪、蒋智勇、陶琦、陈茹、林志雄。Ⅰ犛犖／犜２７０８—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售猪圆环病毒病检疫技术规范１范围本标准规定了猪圆环病毒病的病毒分离、鉴定和疫病诊断等方法的技术要求。本标准适用于猪圆环病毒病的监测、检疫、诊断和流行病学调查。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用

3、于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３缩略语下列缩略语适用于本文件。Ｃｔ值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阀值时所经历的循环数ＣＰＥ：细胞病变效应ＤＮＡ：脱氧核糖核酸ＦＩＴＣ：异硫氰酸荧光黄ＩＦＡ：间接免疫荧光试验ＭＥＭ：最低要求培养基Ｍａｒｋｅｒ：分子量标记物ｎＰＣＲ：巢式聚合酶链式反应ＰＣＶ１：猪圆环病毒１型ＰＣＶ２：猪圆环病毒２型ＰＫ１５：猪肾传代细胞系ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ：荧光聚合酶链式反应ＳＤＳ：十二烷基磺酸钠犜犪狇酶：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶４检疫方法

4、４．１病毒的分离与鉴定４．１．１器材４８孔或９６孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、０．２的微孔滤膜、普通光学显微镜。μｍ１犛犖／犜２７０８—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售４．１．２试剂４４／ｍＬ）溶液。ＭＥＭ培养液、胎牛血清、Ｄ氨基葡萄糖、青霉素（１０ＩＵ／ｍＬ）和链霉素（１０μｇ４．１．３犘犆犞２易感细胞ＰＫ１５细胞。４．１．４犘犅犛见附录Ａ。４．１．５病料采集无菌采集病死猪的腹股沟淋巴结、脾、肺、肾等组织样品或病猪的抗凝血

5、，４℃保存，立即送检。若不能立即送检，应置－２０℃以下条件保存备检。４．１．６病毒分离将采集的组织样品用ＰＢＳ按１∶１０的比例进行稀释，研磨成匀浆，或取病猪的抗凝血，反复冻融３次后，４５００犵离心１５ｍｉｎ，取上清液，经微孔滤膜过滤除菌，接种在无ＰＣＶ感染的正常ＰＫ１５细胞单层上，感作１ｈ，倾尽接种液，加入含２％胎牛血清的ＭＥＭ培养液（含１００ＩＵ／ｍＬ的青霉素和１００／ｍＬμｇ的链霉素），３７℃继续培养２４ｈ，弃上清液，加入３００ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｄ氨基葡萄糖０．５ｍＬ，作用３０ｍｉｎ，倾去，ＰＢＳ洗

6、涤，再加入含２％胎牛血清的ＭＥＭ培养液（含１００ＩＵ／ｍＬ的青霉素和１００／ｍＬ的链霉μｇ素），继续培养２４ｈ～４８ｈ。４．１．７病毒鉴定ＰＣＶ２感染ＰＫ１５细胞后不产生明显的细胞病变效应，故需采用ＩＦＡ（见４．２）或ｎＰＣＲ（见４．３）等方法做进一步的鉴定。４．２间接免疫荧光试验（犐犉犃）４．２．１器材ＩＦＡ诊断板、荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。４．２．２试剂ＰＣＶ２单克隆抗体、ＦＩＴＣ结合物、０．２５％胰蛋白酶、丙酮。４．２．３操作方法４．２．３．１吸取５０μＬ接种过待检样品、经０．２

7、５％胰蛋白酶消化的ＰＫ１５细胞，加入ＩＦＡ诊断板中，置超净工作台中风干，然后加１００丙酮（－２０℃预冷）固定１０ｍｉｎ，同时设正常ＰＫ１５细胞孔和感染了μＬＰＣＶ２的ＰＫ１５细胞孔作为阴、阳性对照。４．２．３．２用ＰＢＳ（１００μＬ／孔）清洗ＩＦＡ诊断板３次，每次３ｍｉｎ，最后弃去ＰＢＳ，在吸水纸上轻轻拍干。滴加工作浓度（ＰＢＳ稀释１０００倍）的鼠源ＰＣＶ２单克隆抗体１００，置于湿盒内，３７℃感作１ｈ。μＬ４．２．３．３ＰＢＳ清洗ＩＦＡ诊断板３次，方法同４．２．３．２。４．２．３．４加入工作浓度（

8、ＰＢＳ稀释５０倍）的兔抗鼠ＦＩＴＣ结合物，１００μＬ／孔，置于湿盒内，３７℃感作３０ｍｉｎ～４５ｍｉｎ。２犛犖／犜２７０８—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售４．２．３．５弃去板中液体，ＰＢＳ清洗４次，方法同４．２．３．２。４．２．４荧光显微镜检查在放大１００×～４００×条件下镜检，荧光显微镜采用蓝紫光（波长：４０５ｎｍ～４９０ｎｍ）。４．２．５结果判定与解释标准阳性细胞孔：细胞边界清晰，胞浆内应出现典型的特异性亮绿色荧光。标准阴性细胞孔