SNT2734-2010传染性鲑鱼贫血病检疫技术规范.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!"!#!"#$"!%&%传染性鲑鱼贫血病检疫技术规范$%&'&()*(+,'-)-.-/0-'*(0+.)*-%11&/2-(&(&+2*&!3!4"!%&%5&&5%&发布!%&&5%'5%&实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７３４—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准是参照世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《水生动物疾病诊断手册））（２００９版）中第２．３．５章的有关内容，同时依据国外在该领域取得的研究成果的基础上制定而成。本标准由国家认证

2、认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局和中华人民共和国沈阳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孔繁德、徐淑菲、刘荭、高隆英、林颖、陈信忠、龚艳清。Ⅰ犛犖／犜２７３４—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售传染性鲑鱼贫血病检疫技术规范１范围本标准规定了用于检测传染性鲑鱼贫血病的临床诊断、病毒分离、间接荧光抗体试验、ＲＴＰＣＲ方法和荧光定量ＲＴＰＣＲ等方法。本标准适用于传染性鲑鱼贫血病的流行病学调查、监测、诊断和出入境检验检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注

3、日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＡＳＫ（ａｔｌａｎｔｉｃｓａｌｍｏｎｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｌｉｎｅ）：大西洋鲑肾细胞系ＣＨＳＥ２１４（ｃｈｉｎｏｏｋｓａｌｍｏｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃｅｌｌｌｉｎｅ）：大鳞大麻哈鱼鱼胚细胞系ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ）：细胞病理变化ＤＡＢＣＯ（１，４Ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［２．２．２］ｏｃｔａｎｅ）：三亚乙基二胺，又名１，４二氮杂二环辛烷ＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）：焦碳酸二乙

4、酯ＥＢ（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）：溴化乙锭ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）：异硫氰酸荧光素ＩＦＡＴ（ｉｎｄｉｒｅｃｔｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｓｔ）：间接荧光抗体试验ＩＳＡ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｓａｌｍｏｎａｎａｅｍｉａ）：传染性鲑鱼贫血病ＭＭＬＶ逆转录酶（ｍｏｌｏｎｅｙｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ）：分离自莫洛尼氏鼠白血病病毒ＳＨＫ１（ａｔｌａｎｔｉｃｓａｌｍｏｎｈｅａｄｋｉｄｎｅｙ）：大西洋鲑前肾细胞系４试剂和材料４．１ＩＳＡＶ标准毒株、ＩＳＡＶ单克隆抗体、兔抗ＩＳＡＶ抗体、荧光标记的羊抗鼠ＩｇＧ、荧光标记的羊抗

5、兔ＩｇＧ、细胞系（ＳＨＫ１、ＴＯ、ＡＳＫ或ＣＨＳＥ２１４细胞）；由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。４．２水：试剂配制（见附录Ａ）用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。４．３犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。４．４ｄＮＴＰ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ。４．５ＭＭＬＶ逆转录酶。４．６ＲＮａｓｉｎ：ＲＮＡ酶抑制剂。４．７引物：所选取的基因为ＩＳＡＶ的第８片段。合成的引物采用无ＤＮＡ酶、无ＲＮＡ酶的超纯水将引物与探针配制成１００／Ｌ储存液，置－２０℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成２０／Ｌ工作μｍｏｌμｍｏｌ１犛犖／犜２７３４—２０１０版权所有·禁止翻

6、制、电子发售液，避免多次冻融。普通ＲＴＰＣＲ：引物浓度为２０／Ｌ，扩增产物大小为１５５ｂｐ。引物序列如下：μｍｏｌ上游引物１：５’ＧＧＣＴＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＡＡＣＧＡＡＴＣ３’下游引物２：５’ＧＣＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＡＧＣＡＣＴＣＣ３’荧光定量ＲＴＰＣＲ：引物和探针浓度为２０／Ｌ，扩增产物大小为１０４ｂｐ。引物和探针序列μｍｏｌ如下：上游引物３：５’ＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴ３’下游引物４：５’ＣＡＧＧＡＴＧＣＣＧＧＡＡＧＴＣＧＡＴ３’探针：５’ＦＡＭＣＡＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＭＲＡ３’４．８异丙醇：分析纯，使用前预冷到

7、－２０℃。４．９无水乙醇：分析纯，使用前预冷到－２０℃。４．１０标准分子量Ｍａｒｋｅｒ：推荐使用１００ｂｐλＤＮＡＭａｒｋｅｒ。５仪器和设备５．１电动匀浆器。５．２倒置显微镜。５．３荧光显微镜。５．４冷冻切片机。５．５高速冷冻离心机。５．６电泳仪。５．７ＰＣＲ扩增仪。５．８荧光定量扩增仪。５．９紫外观察灯或凝胶成像仪。６以临床和病理变化为基础的诊断６．１肉眼观察行为和病理变化肉眼观察行为和病理变化如下：ａ）腮（腮部血液瘀积除外）：外观苍白，贫血的结果，这是最突出的外部