SNT2124-2008大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范.pdf

《SNT2124-2008大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１２４—２００８大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犌狔狉狅犱犪犮狋狔犾狅狊犻狊狅犳犃狋犾犪狀狋犻犮狊犪犾犿狅狀（犌狔狉狅犱犪犮狋狔犾狌狊狊犪犾犪狉犻狊）２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２１２４—２００８前言本标准修改采用了国际兽疫局（ＯＩＥ）《水生动物疾病诊断手册》（２００６版）的第２．１．１４章。本标准与《水生动物

2、疾病诊断手册》（２００６版）的第２．１．１４章相比，主要差异如下：———对聚合酶链式反应和扩增产物的电泳过程进行了优化；———重新编排了格式。本标准的附录Ｂ是规范性附录，附录Ａ、附录Ｃ、附录Ｄ、附录Ｅ、附录Ｆ、附录Ｇ是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘荭、邱杨、江育林、史秀杰、何俊强、高隆英、叶奕优。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜２１２４—２００８大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范１范围本标准规定

3、了大西洋鲑鱼三代虫显微镜检和聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测方法。本标准适用于大西洋鲑鱼三代虫的检疫。２规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—２００８，ＩＳＯ３６９６：１９８７，ＭＯＤ）３概述大西洋鲑鱼三代虫简介参见附录Ａ。４试剂和材料４．１水：符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。４．２甲醛：

4、分析纯。４．３乙醇：分析纯。４．４犜犪狇酶：－２０℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。４．５ｄＮＴＰｓ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏＬ／Ｌ。４．６引物：浓度为４０μｍｏｌ／Ｌ。其序列如下：ＩＴＳ１：５’ＴＴＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴ３’ＩＴＳ２：５’ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＧＴＧＡＴＡ３’扩增内部转录间隔区（ＩＴＳ）中的１３００ｂｐ片段，退火温度为５０℃。ＩＧＳ１：５’ＣＴＧＧＣＴＡＴＡＡＴＣＡＣＧＴＡＡＧＡＣＴＧＣ３’ＩＧＳ２：５’ＡＡＧＡＴＡＣＴＣＡＴＴＴＧＡＣＴＣＧＧＴＧＴＧ３’扩增基因间隔区（ＩＧＳ）中的７３８ｂｐ的片

5、段，退火温度为５５℃。ＬＡ：５’ＴＡＡＴＣＧＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＴＡＡ３’ＨＡ５’ＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＧＣＡ３’扩增线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因中的８９３ｂｐ的片段，退火温度为５０℃。４．７异丙醇：分析纯，使用前预冷到－２０℃。４．８矿物油：要求无ＤＮＡ酶和ＲＮＡ酶，用于无热盖的ＰＣＲ扩增仪。４．９相对分子质量标准。４．１０其他试剂见附录Ｂ。５器材和设备５．１解剖镜。５．２水浴锅。５．３恒温箱。１版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２１２４—２００８５．４普通冰箱和超低温冰箱。５．５

6、台式离心机。５．６ＰＣＲ扩增仪。５．７水平电泳仪。５．８微量移液器。５．９紫外观察灯或凝胶成像仪。５．１０制冰机。５．１１显微镜。６大西洋鲑鱼三代虫的检查和固定６．１大西洋鲑鱼三代虫的检查检查时，将鱼放在盛有运输时所用水的容器中，将鱼完全淹没。用针刺鱼脑，将鱼杀死，以免鱼血污染水。将鱼放在具有良好光线的双筒解剖镜下逐条检查，检查鱼的体表，包括鳃和口腔。在缺乏活鱼检查的条件下，用１０％甲醛或８５％乙醇溶液固定鱼体。用甲醛固定的鱼，三代虫标本呈白色；用乙醇固定的鱼，三代虫呈轻微的暗黄色。检查前将装有鱼的容器放在自来水龙头下，让水流轻轻地通过容器冲洗约２ｈ。在冲洗之前，先要分别检查

7、固定鱼所用的固定剂，包括容器底部的沉淀物，看在固定和运输的过程中有无三代虫从鱼的身体上掉下来。６．２大西洋鲑鱼三代虫的固定先加一滴水到载玻片上，然后将一条寄生虫放到水滴上，轻轻地盖上盖玻片，用一块滤纸在盖玻片的边缘慢慢吸水，直到水基本吸干为止。注意水不要吸得太干，以免压碎虫体。接着滴一小滴ＡＰＧ（见附录Ｂ第Ｂ．１章）到盖玻片的边缘，直至ＡＰＧ溶液浸满盖玻片与载玻片之间的空隙。在玻片上做好标签，标签上要注明宿主种类、虫体的寄生部位、采集地点、采集日期和水温。７大西洋鲑鱼三代虫的形态学鉴定大西洋鲑鱼三代虫的