SNT2693-2010马焦虫病检疫规范.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２６９３—２０１０代替ＳＮ／Ｔ１５２６—２００５马焦虫病检疫规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犈狇狌犻狀犲狆犻狉狅狆犾犪狊犿狅狊犻狊２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２６９３—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１５２６—２００５《马巴贝斯虫病检测方法：微量补体结合试验方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１５２６—２

2、００５相比，主要技术变化如下：———增加了马焦虫病的血液涂片镜检；———增加了间接荧光抗体试验；———增加了酶联免疫吸附试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王玉玲、陈本龙、柴铭骏。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１５２６—２００５。Ⅰ犛犖／犜２６９３—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售马焦虫病检疫规范１范围本标准规定了马焦虫病的血涂片镜检、间接荧光抗体试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验等技术要求。本标准适用于马属

3、动物的马焦虫病检疫、诊断和血清学调查。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３概述参见附录Ａ。４临床症状与病理变化参见附录Ｂ。５被检血清样品采集５．１采血和分离按常规方法采血和分离血清。血清应新鲜，无明显蛋白凝固、无溶血、无腐败气味。５．２运送和保存防止血清冻结和受热，若３ｄ内不能送到实验室，应采用冷藏方法运送。血清应放至４℃冰箱内保存备用。６实

4、验室诊断６．１血涂片镜检６．１．１仪器和设备普通显微镜。６．１．２试剂和材料６．１．２．１姬姆萨染色液，配制方法参见附录Ｃ。１犛犖／犜２６９３—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售６．１．２．２载玻片：处理方法参见附录Ｃ。６．１．３操作步骤６．１．３．１血涂片制备无菌采集动物血液，取５０滴于载玻片的一端约三分之一处，以一端边缘光滑的载波片为推片，μＬ将推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端缘扩散后，自右向左推成薄血膜。将血涂片置空气中干燥，用铅笔在载玻片的标签上编号，注明制片日期。６．１．３．２血涂片染色将制备好的血涂片

5、８０℃热固定５ｍｉｎ，再用５％姬姆萨染液染２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ。染色后涂片用自来水冲洗３次～４次，以除去附着的染料，但不能超过５ｓ，否则样本会脱色。将血涂片空气干燥，先用低倍镜（如１０×１０）观察，再用１００倍油镜下观察红细胞内是否有马焦虫裂殖子。６．１．４结果判定６．１．４．１若见红细胞内的裂殖子呈梨籽形，长２μｍ～５μｍ，直径１．３μｍ～３．０μｍ；成对裂殖子两尖端连接成锐角（参见附录Ｄ），则可确诊此动物为驽巴贝斯虫感染，判定该动物感染马焦虫病。６．１．４．２若见红细胞内裂殖子相对较小，长度小于２μｍ～３μｍ，呈圆

6、形或阿米巴样；成对的裂殖子尖端不连接，常成同端异向并列；通常４个裂殖子组成四联体或马尔他十字形状（参见附录Ｄ），则可确诊此动物为马巴贝斯虫感染，判定该动物感染马焦虫病。６．１．４．３若未见有６．１．４．１和６．１．４．２所描述特征的裂殖子，则宜借助其他试验进一步确诊。６．２间接荧光抗体试验６．２．１仪器和设备６．２．１．１台式离心机。６．２．１．２冰柜：－８０℃。６．２．１．３磁力搅拌器。６．２．１．４荧光显微镜。６．２．１．５微量移液器。６．２．２试剂和材料６．２．２．１Ｐｕｃｋ’ｓＳａｌｉｎｅＧ溶液（ｐＨ７．２）配制

7、方法参见附录Ｅ。６．２．２．２山羊血清。６．２．２．３丙酮，分析纯。６．２．２．４阳性对照血清。６．２．２．５阴性对照血清。６．２．２．６０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ配制方法见附录Ｅ。６．２．２．７ＦＩＴＣ荧光素标记的羊抗马ＩｇＧ。６．２．２．８真空管：容积１５ｍＬ。６．２．２．９载玻片。６．２．２．１０粘质纸带。６．２．２．１１锡箔纸。６．２．２．１２干燥缸。２犛犖／犜２６９３—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售６．２．２．１３染色缸。６．２．２．１４指甲油。６．２．２．１５一次性注射器：规格为１ｍＬ。６．２．

8、２．１６Ｕ型微量反应板。６．２．２．１７湿盒。６．２．３操作步骤６．２．３．１抗原片制作６．２．３．１．１当已知感染马焦虫病动物红细胞染虫率达２％～５％时，采集全血，冷藏方法送至实验室。６．２．３．１．２将装有全血的真空管置台式离心机内４℃，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，用微量移液器吸弃上清液和白细胞层。６．２．