SNT2853-2011闭合孢子虫病检疫技术规范.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８５３—２０１１闭合孢子虫病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犿犻犽狉狅犮狔狋狅狊犿犪犮犽犻狀犻２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准闭合孢子虫病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２８５３—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４

2、６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１．７５字数４９千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６７１定价２７．００元标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５３—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准是参考采用ＯＩＥ的《水生动物疾病诊断手册》（２００６版）中２．２．５章《闭合孢子虫感染》（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｍｉｋｒｏｃｙｔｏｓｍ

3、ａｃｋｉｎｉ），对涉及组织学、透射电镜及原位杂交检测的部分内容进行了补充和完善。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局和中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孔繁德、徐淑菲、刘荭、陈信忠、龚艳清、王景明、周斌华、徐彪。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５３—２０１１闭合孢子虫病检疫技术规范１范围本标准规定了用于检测牡蛎闭合孢子虫病的临床诊断方法、组织印

4、迹法、组织切片法、透射电镜法、ＰＣＲ方法和核酸原位杂交等方法。本标准适用于牡蛎闭合孢子虫病的流行病学调查、监测、诊断和出入境检验检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３材料和设备３．１试剂和材料除另有规定外，下列所用生化试剂均为分析纯。试剂配制方法见附录Ａ。实验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。３．１．１组织切片制备和染色试剂：姬姆萨

5、（Ｇｉｅｍｓａ）染液、苏木精伊红染色液、伊红染液、俾斯麦棕Ｙ、返蓝液：ＢＣＩＰ／ＮＢＴ；Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓ液、甲醛、戊二醛、涂有氨基烷基硅烷的载玻片、盖玻片、石蜡、Ｅｐｓｏｎ８１２、ＤＮＰ３０、ＤＤＳＡ（十二烷基琥珀酸酐）、ＭＮＡ（六甲酸酐）。３．１．２ＤＮＡ提取试剂：蛋白酶Ｋ、酚三氯甲烷抽提法所需要的相关试剂或其他ＤＮＡ抽提试剂盒。３．１．３ＰＣＲ试剂：１０×ＰＣＲ缓冲液（不含镁离子）、２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁、１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、５Ｕ／μＬＨｏｔｓｔａｒｔ犜犪狇聚合酶、ＤＮＡＭａｋｅｒＤＬ２０

6、００、６×电泳上样缓冲液等，均为商品化试剂盒中成分。琼脂糖５×电泳缓冲液（ＴＢＥ）。３．１．４有机试剂：甲醇、无水乙醇、丙酮、甘油、异丙醇、二甲苯、氧化丙烯、封片树胶和液氮。３．１．５无机试剂：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、叠氮钠、醋酸铀、柠檬酸铅和海水。３．１．６引物及探针：包括一对ＰＣＲ引物和地高辛标记的核酸探针，均根据ＳＳＵｒＤＮＡ的基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ４７７６２３：该虫大小为１４５７ｂｐ片段的序列）设计。上游引物：５’ＡＧＡＴＧＧＴＴＡＡＴＧＡＧＣＣＴＣＣ３’（１９ｂｐ，位置３１８～３３

7、６）下游引物：５’ＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＧＣ３’（１７ｂｐ，位置８４７～８６３）该对引物扩增产物大小为５４６ｂｐ。探针：３’端用地高辛标记的探针序列，序列为５’ＡＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＡＣ３’地高辛（１６ｂｐ，位置１２８７～１３０２）。３．１．７阴性和阳性对照：由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。３．２设备３．２．１切片机。３．２．２组织匀浆研磨器。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５３—２０１１３．２．３ＰＣＲ仪。３．２．４扫描电

8、子显微镜。３．２．５制冰机。３．２．６生物安全柜。３．２．７核酸蛋白测定仪。３．２．８高压灭菌锅。３．２．９电泳仪、电泳槽。３．２．１０旋涡振荡器。３．２．１１高速离心机、超速离心机。３．２．１２凝胶成像仪或紫外透射仪。３．２．１３石蜡包埋模具和电镜包埋模具。３．２．１４滤器和滤膜（孔径为０．２２μｍ）。４诊断方法４．１临床诊断方法４．１．１临床症状闭合孢子虫病资料参见附录Ｂ。春季发生