毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选

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时间:2018-09-14

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1、毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备:1.挑取酵母单菌落,接种至含有5mlYPD培养基的50ml三角瓶中,30℃、250-300r/min培养过夜;2.取100-500µl(≤1:100)的培养物接种至含有50ml新鲜培养基的200mL三角摇瓶中,28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h),至OD600达到1.3~1.5;3.将细胞培养物于4℃,1500g离心5min,用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;4.按步骤3离心,用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5.按步骤3离心,用2-5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬;6.按步骤3

2、离心,用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为240ul;备注:可将其分装为80µl一份的包装-70冷冻起来,2周之内使用,但会影响其转化效率。比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛,然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后,转大瓶BMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株,摇瓶一天左右后开始补加甲醇,就类似BMMY的功能了。üKM71比GS115生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的ü对于LOX家族蛋白的表达,可尝试在酵母培养基中加入Cu2+离子,提

3、高表达量和蛋白活性?菌种保存:挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油,-80oCul/管冻存(一般用10ug以上质粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀,70%乙醇洗一遍,约20ulddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kit,回收的DNA可能还有盐,导致电击时放电时间很短。乙醇沉淀主要步骤如下:1)酶切体系(80ul)中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2NaAC,混匀2)-20℃20分钟沉淀3)13200rpm,20min,离心后弃上清4)75%乙醇300ul轻轻洗,同上离心5min,弃上

4、清5)37度烘箱至无乙醇气味(或是用摇床的出风口吹出的暖风吹)。6)20ulddH2O重溶)电击转化:8.将5~20µg的线性化DNA溶解在5~10µlTE溶液中,与80µl的上述步骤6所得的菌体混匀,转至0.2cm冰预冷的电转化杯中;9.将电转化杯冰浴5min;10.根据电转化仪提供的资料,参考其他文献及多次摸索,确定合适的电压、电流、电容等参数,按优化的参数,进行电击;11.电击完毕后,马上加入1ml1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀,转至1.5ml的EP管中;(置于30度摇床低速培养1h,再涂板)12.将菌体悬液涂布于MD平板上,每200~600µl涂布一块平板;

5、13.将平板置于30℃倒置培养,直至单个菌落出现(3-4天)。推荐:电压1.5kV;电容25µF;电阻200Ω。电击时间为4~10msec。Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法1.平板上的菌落长到肉眼可见时(约12小时);2.取1ml酵母悬液4000rmp离心,pbs重悬,煮沸5mins,放到冰上5mins,直接就可以用做pcr的模板了3.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好,并分装。3.用灭菌的牙签挑取菌落,在PCR管中涮一下,PCR扩增,利用5’AOX1和3’AOX1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到Pi

6、chiapastoris基因组,则会扩增到两条带,一条为2.2kb(KM71为3.6kb)宿主茵AOXI基因,另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信号肽序列的片段。)Each50µlaliquotofcompetentPichiacellswith3µglinearizedplasmidDNAwillyield50coloniesonselectivemedium.Muts表型重组酵母的诱导表达实验Asageneralrulewheninducingexpression,neverallowculturestobemorethan10-30%ofyourt

7、otalflaskvolume.1.挑选一单菌落,置于装有50mlMGY、BMG或BMGY培养基的500ml摇瓶中,于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6(~16-18h);2.室温下1500~3000g离心5min,收集菌体,用1/5到1/10原培养体积的MM,BMM或BMMY重悬菌体(约2.5~5ml);3.将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长;4.每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5~1.0%;5.按时间点分

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