SNT2416-2010进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A检测方法电泳和免疫印迹法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４１６—２０１０进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素犃检测方法电泳和免疫印迹法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狅犳狊狋犪狆犺狔犾狅犮狅犮犮犪犾犲狀狋犲狉狅狋狅狓犻狀犃犻狀犳狅狅犱—犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狋犻犮犪狀犱犻犿犿狌狀狅犫犾狅狋犿犲狋犺狅犱２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２４１６—２０１０前言本标准参考了美国ＦＤＡＢＡＭ第１３章《食品中金黄色葡萄球菌肠毒素Ａ电泳和免疫印迹方法》（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ＆ＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＦｏｏｄＳａｆｅ

2、ｔｙ＆ＡｐｐｌｉｅｄＮｕｔｒｉｔｉｏｎＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｔｉｃａｌＭａｎｕａｌＯｎｌｉｎｅＪａｎｕａｒｙ２００１Ｃｈａｐｔｅｒ１３ｂ：ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｎｄＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌＥｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓｉｎＦｏｏｄ）。本标准的附录Ａ为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：冯家望、李丹琳、王小玉、唐食明、郑晶、伍朝辉、游淑珠、陈彬。本标

3、准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２４１６—２０１０进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素犃检测方法电泳和免疫印迹法１范围本标准规定了进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素Ａ的电泳和免疫印迹检测方法。本标准适用于进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素Ａ的检测。２规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ４７８

4、９．１０—２００３食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求３术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１金黄色葡萄球菌肠毒素犃狊狋犪狆犺狔犾狅犮狅犮犮犪犾犲狀狋犲狉狅狋狅狓犻狀犃；犛犈犃由金黄色葡萄球菌产生的蛋白质外毒素，是其中一种主要血清型。３．２免疫印迹法犻犿犿狌狀狅犫犾狅狋将蛋白质转移到固相载体上，利用抗体与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应进行检测。４原理ＳＤＳ（十二烷基磺酸钠）与蛋白质分子结合形成带负电荷的蛋白质ＳＤＳ复合物。在电场的作用下，蛋白质ＳＤＳ复合物向带有异相电荷的电极移动。根据聚丙烯酰胺凝胶分子筛效应

5、，复合物迁移的速度与其分子量成负相关。将电泳分离的组分转移并固定在化学合成膜等固相载体后，以特定的免疫反应以及显色系统分析印迹。５实验室生物安全要求５．１实验室应按照ＧＢ１９４８９对生物安全２级（ＢＳＬ２）实验室的生物安全要求执行。５．２当进行可能产生气溶胶或液体溅出的操作时，或者可能产生大量毒素的实验时，除５．１外，应同时按照ＧＢ１９４８９对ＢＳＬ３安全设备和个体防护的要求执行。５．３使用过的实验用品应按照ＧＢ１９４８９对废弃物进行无害化处理。６设备和材料６．１垂直凝胶系统。１犛犖／犜２４１６—２０１０６．２转移系统。６．３电泳仪：恒压不低于２００Ｖ，恒流不低于４００ｍＡ

6、。推荐使用带有计时器的电源。６．４离心机：适用１．５ｍＬ离心管，转速不低于１００００ｒ／ｍｉｎ。６．５均质器。６．６硝酸纤维膜。６．７涡旋振荡器。６．８扫描仪：推荐辨析率不低于６００ＤＰＩ。６．９离心管：１．５ｍＬ。７试剂１）。７．１ＳＥＡ标准物质（ＳｉｇｍａＳ９３９９）２）。７．２抗ＳＥＡ血清（ＳｉｇｍａＳ７６５６）３）。７．３抗血清碱性磷酸酶（ＳｉｇｍａＡ２５５６）７．４Ｍａｒｋｅｒ：６２００ｋＤａ。７．５ＢＣＩＰ／ＮＢＴ对甲苯胺蓝／氯化硝基四氮唑蓝。７．６ＴＥＭＥＤ四甲基二乙胺。７．７甲醇：分析纯。７．８异丁醇：分析纯。７．９吐温２０。７．１０聚丙烯酰胺凝胶贮液（见附

7、录Ａ第Ａ．１章）。７．１１１０％（质量浓度www.bzfxw.com）过硫酸铵：铝膜覆盖放置１周后使用。７．１２２０％（质量浓度）十二烷基磺酸钠。７．１３缓冲液Ⅰ（见附录Ａ第Ａ．２章）。７．１４缓冲液Ⅱ（见附录Ａ第Ａ．３章）。７．１５１０×电泳缓冲液（见附录Ａ第Ａ．４章）。７．１６点样缓冲液（见附录Ａ第Ａ．５章）。７．１７１０×转移缓冲液（见附录Ａ第Ａ．６章）。７．１８１×转移缓冲液（见附录Ａ第Ａ．７章）。７．１９封闭缓冲液（见附录Ａ第Ａ．８章）。７．２０１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓｐＨ７（见附录Ａ