orc1基因rna干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型的影响

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1、第三军医大学硕士学位论文ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型的影响姓名：李建涛申请学位级别：硕士专业：内科学（心血管病）指导教师：舒茂琴20090501第二军医大学硕士学位论文ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型的影响摘要研究背景和目的：动脉粥样硬化(AtherosclerosisAs)所造成的冠心病、脑卒中等各种血管并发症是世界各国的首要致死和致残原因，现代细胞和分子生物学技术显示动脉粥样硬化病变具有巨噬细胞游移、平滑肌细胞增生；大量胶原纤维、弹力纤维和蛋白多糖等结绨组织形成；以及细胞内、外脂质积聚的特点。血管平滑肌细胞(v

2、ascularsmoothmusclecell，VSMCs)是血管壁的主要组成部分，VSMCs的异常增殖是动脉粥样硬化、经皮冠状动脉介入治疗术后(PerCutaneousCoronauryIntereventionPcI)再狭窄等血管疾病的主要病理基础。血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecellsVSMCs)分为收缩型(分化型)和合成型(未分化型或去分化型)两种表型。收缩表型属于成熟类型，分化程度高。合成表型属于不成熟类型，分化程度低。VSMCs表型转化是高血压、动脉粥样硬化和血管成型术后再狭窄等心血管病vSMCs增殖和迁移

3、的关键性起始步骤。收缩型主要标志物有：a平滑肌肌动蛋白(0L．SMactin)，平滑肌肌球蛋白重链2(SM一2)，Calponin及vimentin等。合成型主要标志物有：基质Gla蛋白和骨桥蛋白(osteopontin)。起始识别复合物(originrecognitioncomplex，ORc)是真核细胞DNA复制起始蛋白，与染色体上的多种复制启动因子协同作用，参与DNA复制的启动，它由6个亚基组成。当ORC与DNA的复制起始位点特异结合后，形成一个平台，之后cdc6、Cdtl及MCM2—7相继结合到ORC上，形成复制前复合物。复制前复合物在多

4、种蛋白和激酶的作用下活化，促进细胞由Gl期进入s期，逐步完成DNA的复制。在芽殖酵母，ORc在整个细胞周期中始终结合在起始点上；在哺乳动物细胞中，oRC2—6在细胞周期各阶段均与染色体结合，而oRCl在s期却从核酸上解离下来，直到下一个细胞周期的G1期才重新结合到染色体上。RNA干扰(RNAinterfering，I斟Ai)作为一种新型的研究基因功能、进行基因治疗的工具，它具有高效、高特异性的特点。ORCI与细胞增殖密切相关，通过在细胞核内与ORC2—5核心复合物迅速的结合或解离，严格控制细胞周期进程，是启动真核细胞DNA复制的关键因子，基于这一

5、认识，本课题前期研究通过脂质体介导siRNA转染大鼠vSMCs，对大鼠ORCl基因表达进行RNA干扰，观察其5第二军医大学硕士学位论文对大鼠VSMCs细胞增殖及细胞周期的影响，证实ORCl基因RNA干扰能抑制血清刺激引起的VSMCs增殖，但是，细胞增殖能力抑制后，作为细胞表型标志物的蛋白如何变化，细胞形态能否向收缩形态转变，细胞表型是否发生改变，尚未进行研究。本实验利用脂质体介导的siRNA抑制ORCl基因的表达，检测VSMCs的形态结构及表型标志物表达量是否改变，探讨ORCl基因抑制后VSMCs的表型转化，旨在为血管损伤性疾病的防治提供新的思路

6、。研究方法：1．用组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉VSMCs，作为对oRCl进RNA干扰、观察其在细胞增殖、细胞表型变化的实验平台；倒置显微镜下形态学观察，免疫荧光法检测伍一SM—actin以鉴定VSMCs。2．使用阳性脂质体“pofect锄ine2000对vsMCs进行siRNA转染；通过westemblot技术检测RNA干扰对ORCl基因的抑制效果。3．通过MTT试验，检测特异性抑制ORCl基因对大鼠VsMCs增殖能力影响。4．oRCl基因RNA干扰对大鼠VSMCs细胞表型影响的检测：免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细胞形态结构；应用流式细胞仪

7、及w．estemblot技术检测细胞表型标志蛋白表达量的变化。研究结果：1．本实验利用组织块贴壁法成功地在体外培养了大鼠VSMCs，并经形态及免疫荧光细胞化学证实，为进一步实验建立了平台；2．以特异性阳性siRNA转染vSMCs，经Westemblot证实能显著抑制oRCl基因的蛋白表达，为进一步试验建立了平台。3．oRCl基因RNA干扰后，正常对照组、阴性转染组及阳性转染组的MTT吸光度值分别为O．1787±O．0412、O．1819±o．0386和O．1065±o．0257，阳性转染组与正常对照组及阴性转染组相比，MTT吸光度值显著下降(p<

8、O．01)，正常对照组与阴性转染组MTT吸光度值无显著差异，阳性转染组VSMCs增殖能力显著下降。4．0RCl基因RNA干扰后，阳性转染