rna干扰ttg基因对肝纤维化的影响 (1)

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1、上海交通大学2005级博士学位论文中文摘要RNA干扰tTG基因对肝纤维化的影响中文摘要肝纤维化是机体对慢性肝损害的损伤一愈合反应，如果肝损害持续可导致肝硬化和肝功能衰竭。HSC活化并引起大量细胞外基质ECM沉积是肝纤维化发生发展的关键环节。因此，在抗肝纤维化的治疗中，除了要尽量消除肝脏损害因素外，其关键是抑制HSC的活化、诱导活化HSC的凋亡并促进ECM的降解。肝脏是表达tTG基因最活跃的器官。tTG在HSC的活化和凋亡中可能起着重要作用，tTG可能通过其TGase活性催化ECM交联而在肝纤维化中发挥重要作用。本研究

2、旨在研究tTG与HSC活化和凋亡的关系及其可能机制，以及tTG基因在肝纤维化中的作用。本研究共分四部分。第一部分大鼠肝星状细胞的分离和培养目的：体外分离和培养大鼠原代HSC。方法：采用Ⅳ型胶原酶肝脏灌注消化及Nycodenz密度梯度离心等方法体外分离、纯化及培养HSC，并以光学显微镜、免疫组化等方法作鉴定。结果：每只鼠肝的HSC的细胞得率为2．5～3．2x107／肝，平均纯度为(94．0-J：1．7)％，活力为(98．0-J：1．8)％。结论：以本方法分离、纯化和培养HSC简单、实用、便捷。第二部分tTG基因RNAi

3、慢病毒载体的构建、鉴定上海交通大学2005级博士学位论文中文摘要目的：设计、构建和鉴定慢病毒介导的tTG基因RNAi质粒。方法：①慢病毒介导的tTG基因的RNAi质粒制备；@RNAi慢病毒包装：③WestemBlot、Real．timePCR筛选RNA干扰有效靶点。结果：①经PCR鉴定和测序验证，成功构建慢病毒介导的tTG基因RNAi质粒；②RNAi慢病毒包装成功，病毒滴度测定结果为4x108TU／ml；③经WesternBlot、Real．timePCR筛选出有效tTG基因RNAi靶点。结论：构建成功慢病毒介导的t

4、TG基因RNAi质粒，并能有效敲减HSC中tTG基因的表达。第三部分慢病毒介导的tTG-RNAi对HSC的影响目的：体外研究慢病毒介导的tTG基因RNA干扰对HSC的活化、增殖和凋亡的影响。方法：大鼠活化HSC共分成三组：正常对照组、无效报告基因(GFP)对照组和Lenti．siRNA．tTG感染组。①分别检测各组HSC中tTG,tx．SMA，collagen．1，TIMP．1／2和MMP．9／13等基因mRNA的表达；②分别检测各组HSC中tTG、0c-SMA、collagen．1和￡一(丫一Glutamyl)Ly

5、sine等基因蛋白的表达；③检测Lenti．siRNA．tTG感染后HSC细胞周期变化；④检测Lenti．siRNA．tTG感染后HSC的增殖情况。结果：Lenti．siRNA．tTG感染HSC后，①能显著抑制tTG的mRNA和蛋白表达，基因抑制效率达到80％以上：②显著抑制MMP9和MMPl3基因的表达，0【．SMA、Collagen．1和TIMP．2基因表达无显著影响，显著降低Collagen一1的蛋白的表达；⑨活化HSC无明显细胞凋亡发生，G1上海交通大学2005级博士学位论文中文摘要期的细胞显著降低，而处于S

6、期的细胞显著增加；④HSC的增殖能力显著降低。结论：慢病毒介导的tTG．RNA干扰质粒能通过抑制tTG的表达而显著抑制HSC的增殖，同时降低HSC中I型胶原的合成，具有潜在的抗纤维化形成的作用。第四部分tTG在肝纤维化形成中的作用目的：探讨tTG基因对大鼠肝纤维化的影响。方法：实验大鼠分成四组：正常对照组、肝纤维化组、siRNA．GFP组和siRNA．tTG组，除正常对照组外各组均建立CCl4诱导肝纤维化模型。siRNA．tTG组分别在注射CCl4的前七天和CCl4注射4w后经门静脉注射Lentivirus．siRN

7、A．tTG，注射剂量(5x107TU／m1)，分别于第4w、8w和12w，处死大鼠，检测肝脏中tTG、0【．SMA、Collagen．1TIMP．1／2和MMP．9／13等基因的表达，检测肝功能和肝脏组织中羟脯氨酸(Hyp)的含量，同时取大鼠肝脏行组织学检查，对肝纤维化程度进行分级评分。分别就以上指标与其他各组进行比较分析。结果：①随着肝纤维化的进展，各组肝内0【．SMA、I型胶原的表达、羟脯氨酸的含量等均显著增加，病理分级也明显提高，而在siRNA．tTG组，上述各项指标均较对照组显著降低；②在第4w，siRNA．

8、tTG组的ALT和AST均显著高于相应对照组，而在8W和12w两个时间点，siRNA．tTG组中ALT和AST含量显著降低。③siRNA—tTG组I型胶原的表达明显降低，而且在肝纤维化后期(12w)尤为明显；QTGF．p的表达在第4w时下降不明显，而在第8w、12W时相较对照组下降明显。结论：在肝纤维化早期，由于慢病毒介导的tTG．RNA干扰质