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时间:2018-09-13
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1、中山大学硕士学位论文MMP-9及TIMP-1在糖尿病鼠皮肤伤口愈合过程中的动态变化姓名:朱平申请学位级别:硕士专业:内科学内分泌指导教师:严励20060601MMP,9及TIMP.1在糖尿病鼠皮肤伤口愈合过程中的动态变化摘要MMP一9及TIMP一1在糖尿病鼠皮肤伤口愈合过程中的动态变化专业:内科学内分泌硕士生:朱平指导教师:严励教授摘要糖尿病(diabetesmellitus,DM)发病率呈持续上升趋势,而其主要并发症之一糖尿病足(diabeticfoot,DF)具有极大的危害性,足溃疡是导致截肢的重要因素,糖尿病足溃疡除了缺血、神经病变和感染等主要原因之
2、外,一些其它的因素也与创面的长期不愈有关。近几年来,较多研究集中在探讨急性和慢性伤口发生的分子机制方面,试图找出使急性伤口向慢性伤口转化的原因。创面愈合过程与细胞外基质(ExtracellularMatrix,ECM)的动态平衡密切相关,ECM是由蛋白、蛋白多糖和胶原等组成的三维网状结构,而在ECM合成和降解的代谢平衡调节中,基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinase,MMPs)及组织金属蛋白酶抑$1J剂(Tissueinhibitorsofmetalloproteinase,TIMPs)两类酶系统在其中发挥重要作用。MMPs是一组具有
3、共同生化性质的可降解ECM的锌依赖性肽链内切酶,是参与ECM降解的主要蛋白酶之一,TIMPs是MMPs的特异性抑制因子,能调节MMPs的活性,在正常创面愈合过程中MMPs/TIMPs与失活组织的清除、角质形成细胞的迁移、血管形成、结缔组织的重塑和生长因子的调节等有关。既往对于MMPs/TIMPs与慢性创面难愈的研究主要集中在压力性溃疡或静脉性溃疡,而且主要研究局部伤口渗液或者组织中MMPs/TI御s的单个时间点的改变。对糖尿病足溃疡研究较少,糖尿病动物皮肤伤口的研究也仅仅涉及到个别MMPs的变化,并且没有同时进行相应的TIMPs的探讨。MMPs/TIMPs
4、在糖尿病皮肤难愈溃疡中的具体作用机制仍不清楚,这就需要我们深入探讨在慢性伤口愈合过程中是否存在基质金属蛋白酶调控失衡及其与创伤修复之间的关系,为寻找治疗临床难愈性创伤修复的新方法提供实验依据。MMP一9及"lIMP—l在糖尿病鼠皮肤伤口愈合过程中的动态变化摘要研究目的1.建立糖尿病大鼠伤口模型和伤口愈合的评价体系。观察正常大鼠和糖尿病大鼠皮肤伤口愈合过程中伤口愈合速度、组织学和病理生理学的变化;2.观察糖尿病鼠皮肤伤口愈合过程中不同时间点(d。、d。、d,、d14)MMP一9、TIMP.1和MMP一9/TIMP一1比值表达的动态变化。材料与方法1.糖尿病大
5、鼠模型的建立选用250克左右清洁级SD大鼠随机分为正常组和实验组,STZ注射前基础随机血糖<6.7mmol/L,适应性饲养1周后予40mg/kg体重STZ连续3d腹腔内注射诱导糖尿病,注射3d后尾静脉采血检测随机血糖水平,注射后随机血糖水平≥16.7mmol/L,视为糖尿病模型建立成功。两组大鼠实验期间自由进食、饮水,每周监测体重和血糖,糖尿病组大鼠根据血糖水平皮下注射鱼精蛋白锌胰岛素卜3U/d,以保证血糖维持16.7mmol/1以上,同时降低酮症的发生,减少模型大鼠的死亡。2.皮肤伤口模型的建立正常大鼠和糖尿病大鼠成模6w后,水合氯醛300mg/kg腹腔
6、注射麻醉,背部剪毛,75%酒精消毒,以边长为1.3cm的消毒模板作为标志用手术刀在鼠背部正中距离颅骨后1cm处形成一个1.3×1.3cm的正方形伤口,切除范围深达筋膜,伤口形成后每个鼠单笼饲养。整个伤口(包括伤口周围的5mm内的正常皮肤)直至筋膜被切除进行分析,部分标本液氮保存用于RT-PCR、Westernblot,部分标本固定于4%的多聚甲醛溶液中,用于组织学和免疫组化检查。3’.实验动物分组实验分为2个大组:正常正常组(N)和糖尿病组(D),N组再分为4小组,分别为Ndo(造伤口当天)、Nd3(伤口形成后第3天)、Nd7(伤口形成后第7天)、Ndl4
7、(伤口形成后第14天),每组7只大鼠;D组也再分为4小组,分别为Ddo(造伤口当天)、Dd3(伤口形成后第3天)、Dd7(伤口形成后第7天)、Ddl4(伤口形成后第14天),每组6只大鼠。4.伤口愈合率评价TTMMP一9及TIMP.1在糖尿病鼠皮肤伤口愈合过程中的动态变化摘要用数码相机在固定的距离内进行拍摄(BX-29,Canon),同时放置一个有刻度直尺并标明大鼠的号码和照像日期。伤口面积用ImageJ(1.0.3版本)进行计算,用鼠标描出伤口边缘然后计算面积。每次测量重复2次,取其平均数。根据以下公式计算伤口愈合的百分率,愈合率=(伤口面积(Od)一伤
8、口面积(nd))/伤口面积(Od)×100。5.皮肤组织HE(Ha
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