无菌检查法培训课件

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1、无菌检查法培训一、检测标准《中华人民共和国药典》2010年版附录无菌检查法（2010年7月1日起执行）二、检测环境

2、无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。

3、洁净度标准：《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

4、无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数：每次操作时在层流空气所及台面的左中右置3个营养琼脂平板，暴露30min，于30～35℃培养48小时，菌落数平均应不超过1CFU/平板。三、名词解释1、好氧微生物：在代谢中，有氧条件下才能生存

5、的微生物。2、厌氧微生物：在代谢中，没有氧条件下才能生存的微生物。3、兼性微生物：能够在有氧和无氧条件下代谢的微生物。4、培养条件：用于促进微生物发育、生长和繁殖的生长培养基和培养方式的组合。5、假阴性：实际阳性的无菌实验结果被变成了阴性。6、假阳性：实际阴性的无菌实验结果被变成了阳性。7、促生长实验：用于证明生长培养基能够支持微生物生长的技术条件。四、样品量

6、检验数量：是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。

7、检验量：指一次试验所用的供试品总量。

8、除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3中最少检验数量不包

9、括阳性对照试验的供试品用量。（一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用。）

10、表1批出厂产品最少检验数量

11、表2.液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量

12、表3.固体制剂最少检验量及上市抽检样品的最少检验数五、实验材料的准备1、培养基及稀释液（1)硫乙醇酸盐流体培养基（2）改良马丁培养基（3）pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液2、培养基的制备及培养条件

13、直接购买配制好的干粉培养基，按培养基包装上的说明，取规定量的干粉培养基及蒸馏水进行配制之后，按说明上的温度

14、、时间要求进行培养基灭菌。注：对硫乙醇酸盐流体培养基，配好后，须煮沸，再灭菌。培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5。

15、硫乙醇酸盐流体培养基，置30～35℃培养。

16、改良马丁培养基，置23～28℃培养。3、其他实验材料

17、剪刀、镊子

18、滤器、微孔滤膜

19、量筒

20、培养器

21、以上材料可以采用干热灭菌（只限于剪刀、镊子，灭菌时将剪刀和镊子装入专用灭菌器具内）或湿热灭菌。干热灭菌为160℃2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用。4、培养基的适用性检查

22、无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本

23、检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。

24、无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长。

25、灵敏度检查菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

26、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)〔CMCC(B)26003〕

27、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)〔CMCC(B)10104〕

28、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）〔CMCC（B）635

29、01〕

30、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)〔CMCC(B)64941〕

31、白色念珠菌(Candidaalbicans)〔CMCC(F)98001〕

32、黑曲霉(Aspergillusniger)〔CMCC(F)98003〕

33、菌液制备

34、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基；接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18小时～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23～28℃培养24～48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化

35、钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。

36、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

37、菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

38、培养基接种取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流

39、体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各