水稻circRNA定向敲除突变体创制及分析

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1、电子科技大学UNIVERSITYOFELECTRONICSCIENCEANDTECHNOLOGYOFCHINA硕士学位论文MASTERTHESIS论文题目水稻circRNA定向敲除突变体创制及分析学科专业生物化学与分子生物学学号201521090320作者姓名辛旭辉指导教师郑雪莲副教授分类号密级注1UDC学位论文水稻circRNA定向敲除突变体创制及分析辛旭辉指导教师郑雪莲副教授电子科技大学成都申请学位级别硕士专业学位类别生物化学与分子生物学提交论文日期2018.04论文答辩日期2018.05.29学位授予单位和日期电子科技大学2018年6月答辩委员会主席评阅

2、人注1：注明《国际十进分类法UDC》的类号。CreationandidentificationofcircRNAknockoutmutantsinriceAMasterThesisSubmittedtoUniversityofElectronicScienceandTechnologyofChinaDiscipline:BiochemistryandmolecularbiologyAuthor:XinXuhuiSupervisor:ZhengXuelianSchool:Schooloflifescienceandtechnology摘要摘要环状RNA（circ

3、ularRNA，circRNA）是一种新兴的内源非编码RNA（nocodingRNA,ncRNA）,呈封闭环状，这与传统的线性RNA（linearRNA）结构不同。circRNA通过外显子环化或者内含子环化将3’和5’末端连接起来形成完整的环状结构，不受RNA外切酶影响，因而比线性RNA更稳定，更具有保守性，可以在生物体中以多种类型大量存在。CircRNA在miRNA功能研究和基因转录中起到重要的调控作用。由于其独特的分子结构和潜在的基因组功能，受到人们的普遍关注。目前已经从动植物体中陆续发现了一些circRNA，但是阐明功能的circRNA非常少，其中一个最

4、主要的原因是缺少circRNA突变体。本研究基于基因组定向修饰技术，针对Os02circ25329，Os06circ02797，Os03circ00204，Os01circ14411，Os05circ02465五个水稻基因组中的环状RNA进行敲除突变体材料创制，进而针对所得到的突变体材料，进行纯合突变体材料的筛选和测序，分析CRISPR-Cas9定向修饰技术在水稻基因组中敲除环状RNA大片段的效率。而对于所筛选得到的突变体植株，后续可以对其进行转录组测序，以分析其功能。本文研究内容及结果如下：1.针对环状RNAOs02circ25329，Os06circ027

5、97，Os03circ00204，Os01circ14411，Os05circ02465，构建了5个CRISPR-Cas9定向修饰表达载体，载体编号依次是pZJP053，pZJP054，pZJP055，pZJP056，pZJP057。每个载体含有两个sgRNA定向修饰位点；2.利用农杆菌介导方式进行水稻遗传转化，得到了274个水稻转基因阳性再生植株，其中pZJP053得到43个植株，pZJP054得到15个植株，pZJP055得到111个植株，pZJP056得到61个植株，pZJP057得到44个植株；3.对所得部分转基因阳性植株的单个位点进行了突变检测。其中

6、，pZJP053-sgRNA1定向修饰位点突变效率为56.5%，pZJP053-sgRNA2定向修饰位点突变效率为47.8%；pZJP054-sgRNA1定向修饰位点突变效率为60.0%，pZJP054-sgRNA2定向修饰位点突变效率是33.3%；pZJP055-sgRNA1定向修饰位点突变效率为30.4%，pZJP055-sgRNA2定向修饰位点突变效率为8.7%；pZJP056-sgRNA1定向修饰位点突变效率为100.0%，pZJP056-sgRNA2定向修饰位点突变效率为95.7%；pZJP057-sgRNA1定向修饰位点突变效率为47.8%，pZJ

7、P057-sgRNA2定向修饰位点突变效率为47.8%。4.对所得转基因阳性植株进行检测，共得到了23个目标circRNA位点大片段I摘要敲除的T0代突变体单株。其中，pZJP053得到6个敲除突变体单株，突变效率为14.0%；pZJP054得到1个单株，突变效率为6.7%；pZJP055得到5个敲除突变体单株，突变概率是4.5%，pZJP056得到5个敲除突变体单株，突变效率是8.2%；pZJP057得到6个敲除突变体单株，突变效率为13.6%。5.对已得到的T1代植株进行了纯合突变植株的筛选，其中针对环状RNAOs02circ25329，Os03circ0

8、0204，Os05circ02465，