浅析新基因NOR1对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响

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1、浅析新基因NOR1对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响【摘要】　　目的:研究NOR1基因对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响。方法:将(+)/NOR1的表达质粒经脂质体导入HepG细胞,Northernblot筛选出阳性克隆,通过双向电泳分离过表达NOR1的HepG2细胞内蛋白质,筛选出差异表达的蛋白质点,并进行质谱分析鉴定。结果:鉴定出6种表达上调的蛋白质点,包括锌指蛋白、肿瘤坏死因子受体、酪氨酸蛋白磷酸化受体等,这些蛋白质涉及基因转录、信号转导等肿瘤发生相关事件。结论:NOR1基因可能通过

2、上调这些蛋白参与多种途径影响肝癌的发生发展。【关键词】NOR1基因双向电泳基质辅助激光解吸飞行时间质谱硝基还原酶基因NOR1是课题组克隆的一个与亚硝胺类化合物致癌密切相关的新基因[1],GenBank登录号为AF462348。人体多组织Northernblot表达分析显示NOR1基因在所检测的肝、脑、肾、肺、脾脏、骨骼肌等12种正常组织中广泛表达,且有2个转录本(1600bp,1200bp)[2]。通过构建NOR1基因真核表达载体及NOR1基因转染HepG2肝癌细胞系,发现NOR1基因转染可引起IL

3、8的表达升高[3,]。为了深入研究NOR1基因功能,本试验运用转基因技术构建过表达NOR1基因肝癌细胞系HepG2,采用高通量的蛋白质组技术研究过表达NOR1肝癌细胞系HepG2后蛋白质表达谱的改变,通过对差异蛋白点的鉴定与分析,探讨NOR1基因在肝癌发生、发展中的作用。　1材料和方法材料人肝癌细胞系HepG2细胞由中南大学湘雅三医院检验科保存;(+)载体为哺乳动物高效表达载体,为Invitrogen公司的产品;(+)/NOR1载体由中南大学湘雅三医院检验科构建;随机引物标记盒购自美国Promega公

4、司;TRIzolTM试剂购自美国Gibcol/BRL公司;蛋白质相对分子质量(Mr)标准购自中科院上海生物化学研究所;同位素α32pdCTP、α33pdATP,购自北京福瑞公司;引物由大连宝生物有限公司合成;固相pH梯度干胶条、载体两性电解质、IPG缓冲液、覆盖液、石蜡油、银染试剂盒、IPGphor电泳单元及双向电泳附件、EPS500电源、重泡胀附件和循环水浴箱等电聚焦系统、IPGPhor电泳系统等购自Pharmacia公司;丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺为国产分析纯;乙腈为国产色谱纯;其他试剂为

5、国产分析纯试剂;垂直平板电泳系统、循环水浴箱购自BioRad公司;PDQUESTD胶分析系统购自BioRad公司。方法(+)/NOR1/HepG2稳定表达系的建立方法详见文献[3]。上游引物为5′ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT3′,下游引物为5′TCTCAGCCCTCTTTCAAAAACTTCTC3′;为了进一步验证稳定细胞系的建立,我们还使用Northernblot方法进行了验证,方法见分子克隆操作。蛋白抽提与定量细胞培养至对数生长期,弃出培养液,用胰酶消化,PBS洗

6、后约2×106细胞中加入50μL裂解液,液氮反复冻融后,加20μLRNase(20g/L)在4℃放置1min,13000r/min,℃离心30min,收集上清液,样品存放-70℃。蛋白定量用BSA方法操作,每次上样量为300mg。等电聚焦电泳及银染采用IPGphor等电聚焦系统,把干胶条置于胶条盒中放置在IPGphor电泳仪上水化15～1h,水化完毕按500V,1000V各1h,000Vh等电聚焦聚焦结束后,取出胶条,加入平衡液A振荡平衡1min,再换平衡液B(mol/Lurea,/LTrisHCl

7、,0g/LSDS,00g/L甘油,1g/L碘乙酰胺)振荡平衡1min,取出胶条滤干。第二向SDSPAGE基本上按照Bjellguist的方法进行。采用分离胶浓度为1g/L的不连续SDSPAGE垂直平板电泳。银染按银染试剂盒操作手册操作。图像分析通过PDQuestD分析软件系统,分别比较4次重复结果图谱,将HepG2和转染NOR1细胞的进行匹配分析,获得NOR1基因转染所致的蛋白质差异表达变化,将这些蛋白点在双向电泳凝胶图谱上标出。蛋白质的原位酶解蛋白质原位酶解按Fernandez[5]和Ghar

8、ahdaghi[6]的方法进行。MADLITOF肽质指纹图分析在样品中加入10μL1g/LTFA水溶液,振荡,使样品充分溶解,再用美国Millipore公司的10μLZipTipTMC18器嘴脱盐。制备好的样品使用美国BRUKER公司的ProFlexTMIIIMADLITOF质谱仪进行分析。2结果.1阳性克隆的鉴定将挑选出来的单克隆细胞扩大培养,抽提RNA进行RTPCR鉴定。共挑选出8个单克隆细胞,用RTPCR鉴定,其中有4个为阳性克隆。为了进一