新基因nor1对肝癌细胞系hepg2蛋白质表达谱的影响

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1、新基因NOR1对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响：聂新民*,周建大,黄竹英,桂嵘,李登清,唐华【摘要】　　目的:研究NOR1基因对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响。方法:将pcDNA3.1(+)/NOR1的表达质粒经脂质体导入HepG2细胞,Northernblot筛选出阳性克隆,通过双向电泳分离过表达NOR1的HepG2细胞内蛋白质,筛选出差异表达的蛋白质点,并进行质谱分析鉴定。结果:鉴定出6种表达上调的蛋白质点,包括锌指蛋白、肿瘤坏死因子受体、酪氨酸蛋白磷酸化受体等,这些蛋白质涉及基因转录、信号转导

2、等肿瘤发生相关事件。结论:NOR1基因可能通过上调这些蛋白参与多种途径影响肝癌的发生发展。【关键词】NOR1基因双向电泳基质辅助激光解吸飞行时间质谱　　硝基还原酶基因NOR1是课题组克隆的一个与亚硝胺类化合物致癌密切相关的新基因[1],GenBank登录号为AF462348。人体多组织Northernblot表达分析显示NOR1基因在所检测的肝、脑、肾、肺、脾脏、骨骼肌等12种正常组织中广泛表达,且有2个转录本(1600bp,1200bp)[2]。通过构建NOR1基因真核表达载体及NOR1基因转染HepG2肝癌细胞

3、系,发现NOR1基因转染可引起IL8的表达升高[3,4]。为了深入研究NOR1基因功能,本试验运用转基因技术构建过表达NOR1基因肝癌细胞系HepG2,采用高通量的蛋白质组技术（双相电泳,质谱）研究过表达NOR1肝癌细胞系HepG2后蛋白质表达谱的改变,通过对差异蛋白点的鉴定与分析,探讨NOR1基因在肝癌发生、发展中的作用。　　1材料和方法　　1.1材料人肝癌细胞系HepG2细胞由中南大学湘雅三医院检验科保存;pcDNA3.1(+)载体为哺乳动物高效表达载体,为Invitrogen公司的产品;pcDNA3.1(+

4、)/NOR1载体由中南大学湘雅三医院检验科构建;随机引物标记盒购自美国Promega公司;TRIzolTM试剂购自美国Gibcol/BRL公司;蛋白质相对分子质量(Mr)标准购自中科院上海生物化学研究所;同位素α32pdCTP、α33pdATP,购自北京福瑞公司;引物由大连宝生物有限公司合成;固相pH梯度干胶条（pH3～10,18cm）、载体两性电解质（pH3～10）、IPG缓冲液、覆盖液（DrystripcoverFluid）、石蜡油、银染试剂盒、IPGphor电泳单元及双向电泳附件、EPS3500电源、

5、重泡胀附件和循环水浴箱等电聚焦系统、IPGPhor电泳系统等购自Pharmacia公司;丙烯酰胺（acrylamide）、亚甲基双丙烯酰胺（Bis）为国产分析纯;乙腈（A）为国产色谱纯;其他试剂为国产分析纯试剂;垂直平板电泳系统、循环水浴箱购自BioRad公司;PDQUEST2D胶分析系统购自BioRad公司。　　1.2方法　　1.2.1pcDNA3.1(+)/NOR1/HepG2稳定表达系的建立方法详见文献[3]。上游引物为5′ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT3′,下游引物为5′TCT

6、CAGCCCTCTTTCAAAAACTTCTC3′;为了进一步验证稳定细胞系的建立,我们还使用Northernblot方法进行了验证,方法见分子克隆操作。　　1.2.2蛋白抽提与定量细胞培养至对数生长期,弃出培养液,用胰酶消化,PBS洗后约2×106细胞中加入50μL裂解液（8mol/Lurea,40g/LCHAPS,40mmol/LTris,65mmol/LDTT）,液氮反复冻融后,加20μLRNase(20g/L)在4℃放置15min,13000r/min,4℃离心30min,收集上清液,样品存放-70℃。蛋

7、白定量用BSA方法操作,每次上样量为300mg。　　1.2.3等电聚焦电泳及银染采用IPGphor等电聚焦系统,把干胶条置于胶条盒中放置在IPGphor电泳仪上水化（水化液组成为:8mol/Lurea,5g/LCHAPS,2.8g/LDTT及痕量溴酚蓝）15～18h,水化完毕按500V,1000V各1h,8000V5h等电聚焦聚焦结束后,取出胶条,加入平衡液A（8mol/Lurea,0.5mol/LTrisHCl,20g/LSDS,300g/L甘油,1g/LDTT）振荡平衡15min,再换平衡液B(8mol/Lu

8、rea,0.5mol/LTrisHCl,20g/LSDS,300g/L甘油,15g/L碘乙酰胺)振荡平衡15min,取出胶条滤干。第二向SDSPAGE基本上按照Bjellguist的方法进行。采用分离胶浓度为15g/L的不连续SDSPAGE垂直平板电泳。银染按银染试剂盒操作手册操作。　　1.2.4图像分析通过PDQuest2D分析软件系统,分别比较4