氯沙坦对糖尿病大鼠肾组织细胞外基质基因表达影响的研究

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1、氯沙坦对糖尿病大鼠肾组织细胞外基质基因表达影响的研究作者：魏明李素娟佘红纯卢永申【摘要】目的探讨氯沙坦对糖尿病(DM)大鼠肾组织细胞外基质转化生长因子β1(TGFβ1)、纤维连接蛋白(FN)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)mRNA表达的影响。方法8只大鼠分为对照组;DM组：链脲佐菌素(STZ)70mg/kg腹腔注射;氯沙坦干预组(氯沙坦组)：氯沙坦30mg·kg-1·d-1灌胃，检测各组在2、4、w的尿白蛋白及肾脏肥大指数;采用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术检测TGFβ1、FN、ColⅣmRNA表达。结果DM组和氯沙坦组中TGFβ1，ColⅣ和

2、FNmRNA的表达显著高于对照组(均P)。结论氯沙坦具有抑制DM大鼠肾组织细胞外基质基因表达的作用。【关键词】Ⅳ型胶原;糖尿病肾病;转化生长因子β1;氯沙坦;纤维连接蛋白糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)主要的微血管并发症之一，如何阻止与延缓其发生、发展，已成为DM研究的重点。细胞因子在DN发病中的作用越来越得到人们的关注。为此本研究利用血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)拮抗剂氯沙坦对DM大鼠肾组织转化生长因子β1(TGFβ1)、纤维连接蛋白(FN)和Ⅳ型胶原(COLⅣ)mRNA表达的作用进行研究，以期进一步探讨其可能的作用机制。　1材料与方法动物分组和模型建立

3、SD大鼠30只(体重160～180g，雌雄各半)，购自郑州大学医学实验动物中心，随机分为3组，每组10只：正常对照组(对照组);DM组：链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)70mg/kg腹腔注射，4h后尾静脉采血测定血糖≥/L者确定为DM大鼠;氯沙坦干预组(氯沙坦组)：DM模型确定后第2天给予氯沙坦30mg·kg-1·d-1灌胃，对照组和DM组给予等量的生理盐水灌胃，实验期间所有大鼠自由饮水，标准饲料不使用胰岛素和其他降糖药。1.标本采集和检测于实验第2、4、w各组随机取10只大鼠，用代谢笼收集2h尿液，采用免疫散射比浊法检测尿白蛋白(试剂北京九强生物工程公司)

4、。之后禁食10h，20%乌拉坦麻醉后由腹主动脉采血，000r/min离心min分离血清，用美国BeckmanCoulter公司CX9全自动生化分析仪检测血糖、尿素氮、肌酐。肾脏肥大指数以肾重/体重(g/kg)比值表示。留取肾脏标本用生理盐水漂洗后，保存于液氮中待提取总RNA。1.引物设计和RTPCR检测取肾皮质100mg加液氮研碎后，用Trizol(美国Gibco公司)提取总RNA。根据A260/A280值计算RNA的浓度和纯度。TGFβ1mRNA上游引物为：5′AATACGTCAGACATTCGGGAAGCA3′，下游引物为：5′TCCACCACC

5、CTGTTGCTGAC3′，扩增产物为49bp，GAPDH上游引物为：5′ACCACAGTCCATGCCATCTA3′，下游引物为：5′TCCACCACCCTGTTGCTGAC3′,扩增产物为49bp;ColⅣmRNA上游引物为：5′GTGCGGTTTGTGAAGCACCG3′，下游引物为：5′GTTCTTCTCATGCACACTTC3′，扩增产物为36bp;GAPDH上游引物为：5′CATGGTCTACATGTTCCAGT3′，下游引物为：5′GGCTAAGCAGTTGGTGGTGC3′，扩增产物为50bp;FNmRNA上游引物为：5

6、′CAGTTTGTGGAAGTGACCGA3′，下游引物为：5′TGGAGGTTAGTGGGAGCATA3′，扩增产物为27bp，GAPDH上游引物为：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游引物为：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，扩增产物为34bp(以上引物有上海生物工程公司合成)。PCR按逆转录二步法试剂盒(Invitrogen)进行操作，反应参数为：94℃0s，58℃0s，72℃120s，共30个循环，产物用2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，并在UVP凝胶成像系统分析电泳带灰度。1.统计学处理计量资料用x±s表示

7、，组间差异比较采用单因素方差分析，使用统计软件进行统计描述。　结果.1各组大鼠基本资料比较实验第2、4、8周后，DM组血糖、尿素、2h尿白蛋白、血肌酐均高于对照组差异显著(P)，见表1。.RTPCR检测肾皮质ColⅣ、FN和TGFβ1mRNA的表达在各组观察时间点DM组和氯沙坦组TGFβ1、FN和ColⅣmRNA均高于对照组(P讨论有实验〔1〕研究表明，TGFβ1可刺激培养的近端肾小球肾小管上皮细胞合成外基质，并可抑制细胞外基质降解酶的合成，使细胞外基质分解受到抑制，这两方面促进了细胞外基质积聚。Kawano等〔2〕学者将TGFβ1基因转染到大鼠肾

8、脏后出现了细胞外基质蓄积