基于mGluR2和mGluR3受体激动作用对蜘蛛香环烯醚萜类成分抗焦虑机制研究

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1、国内图书分类号：R285.5密级：公开国际图书分类号：西南交通大学研究生学位论文基于mGluR2和mGluR3受体激动作用对蜘蛛香环烯醚萜类成分抗焦虑机制研究年级二〇一五级1姓名张雪梅1申请学位级别医学硕士1专业药学1指导老师闫智勇教授1李韶菁副教授1二零一八年五月ClassifiedIndex:R285.5U.D.C:SouthwestJiaotongUniversityMasterDegreeThesisAnxiolyticMechanismofIridoidsofRootsandRhizomesofValerianajatamansiJonesBasedontheAgonismo

2、fmGluR2andmGluR3Grade：2015Candidate：XuemeiZhangΑcademicDegreeAppliedfor：MasterofMedicineSpeciality：PharmacySupervisor：Prof.ZhiyongYanAsso.Prof.ShaojingLiMay,2018西南交通大学硕士研究生学位论文第I页摘要目的探讨基于第Ⅱ组代谢型谷氨酸受体（mGluR2和mGluR3）激动作用的蜘蛛香环烯醚萜类成分抗焦虑机制。方法1.采用脂质体转染方法构建Vero-Ga15-mGluR2细胞和Vero-Ga15-mGluR3细胞，并采用Real-T

3、imePCR验证目的基因GNA15、mGluR2和mGluR3的表达。2.采用CCK-8法检测不同浓度的蜘蛛香总环烯醚萜（totaliridoidsofrootsandrhizomesofValerianajatamansiJones，TIV）、蜘蛛香素E、mGluR2和mGluR3激动剂（LY354740）和谷氨酸对Vero-Ga15-mGluR2细胞和Vero-Ga15-mGluR3细胞存活的影响，以便确定药物的浓度。采用Fluo-3/AM作2+为钙离子（Ca）荧光探针，使用高内涵药物筛选系统检测TIV和蜘蛛香素E2+对Vero-Ga15-mGluR2和Vero-Ga15-mGlu

4、R3细胞内Ca荧光强度的影响。3.采用梯度离心法制备大鼠大脑皮质突触体，运用透射电子显微镜鉴定其微观形态，以及检测突触体乳酸脱氢酶（LDH）活性。采用流式细胞仪检测TIV和蜘蛛香2+素E对大鼠大脑皮质突触体内Ca荧光强度的影响。4.采用大鼠应激焦虑模型，通过高架十字迷宫和敞箱行为学实验验证TIV抗焦虑作用，酶联免疫法检测大鼠大脑皮质的腺苷酸环化酶（AC）活性、环磷酸腺苷（cAMP）含量、谷氨酸（Glu）含量，WesternBlot法检测大鼠大脑皮质PKA//、mGluR2和mGluR3蛋白表达水平。结果1.转染细胞—Vero-Ga15-mGluR2和Vero-Ga15-mGluR

5、3构建成功，目的基因GNA15、mGluR2和mGluR3的表达量高，符合细胞实验的要求。2.用高内涵药物筛选系统检测TIV和蜘蛛香素E对Vero-Ga15-mGluR2细胞和Vero-Ga15-mGluR3细胞钙流的影响，对于Vero-Ga15-mGluR2细胞，与正常组相比2+较，阳性药组Ca荧光平均值显著增强（P<0.05）；谷氨酸组、3µg/mL和12µg/mLTIV组、10µM和20µM蜘蛛香素E组荧光值非常显著增强（P<0.01）；对于Vero-Ga15-mGluR3细胞，与正常组相比，阳性药组，12µg/mLTIV组荧光平均值非常显著增强（P<0.01）；谷氨酸组，6µg

6、/mLTIV组，10µM蜘蛛香素E组荧光值显著增强（P<0.05）。3.通过电镜观察，制备的突触体包含典型的突触体形态结构特征；检测突触体的乳酸脱氢酶活性，悬液中总的乳酸脱氢酶活西南交通大学硕士研究生学位论文第II页性与上清液维持在一定比例不变，用流式细胞仪检测蜘蛛香环烯醚萜类成分对2+突触体内Ca的影响，与正常组相比较，阳性药组、6µg/mLTIV组、20µM蜘蛛香素E组荧光平均值非常显著降低（P<0.01）；10µM蜘蛛香素E荧光值显著降低（P<0.05）。4.大鼠应激焦虑模型成功建立，在2个焦虑模型行为学实验中，模型组动物产生了焦虑状态，而阳性组及TIV各剂量组（5、10和20m

7、g/kg）动物的焦虑行为均有明显改善。抗焦虑机制研究结果显示，与模型组比较，TIV的高、低剂量组大脑皮质AC活性，中剂量组大脑皮质的cAMP含量，高、中剂量组大脑皮质的Glu含量均非常显著降低（P<0.01），高剂量组大脑皮质的cAMP含量显著降低（P<0.05）；高、低剂量组mGluR2表达水平和中、低剂量组mGluR3表达均非常显著增加（P<0.01）；中、低剂量组PKA//表达水平非常显著降低（P<0.01）。结论1.蜘蛛香环烯醚萜