人源抗HBs基因工程抗体在E. coli中的高效表达与折叠.doc

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1、人源抗HBs基因工程抗体在E.coli中的高效表达与折叠作者：刘雪林，唐晓敏，宋宏彬，李申龙，徐德忠【关键词】HbsAg；Fab段；表达；复性　　1材料和方法　　11表达质粒的构建从含有人源性抗HBsAg抗体Fab段基因的噬菌体［1］中扩增出重链Fd片段，上游引物5′gcggaattcatatggtt(G)aaactgctg(C)gaa(G)cagtctg′cggaattcattaa(T)g(C)ag(A)gtc(T)ttgtcacag(A)gac(T)ttt(G)ggt(C)t(C)caactttc3′；从上述噬

2、菌体中扩增出轻链基因，上游引物5′gcggaattcatatggaa(G)ctg(C)gtt(G)atgact(C)cagtctccagacacc3′和下游引物5′cggaattcattaacat(C)tca(T)cct(C)ctgttgaagctcttc3′.为便于亚克隆和满足表达的要求，在上游引物的5′端引入NdeI酶切位点(下划线处，并含起始密码子ATG)，下游引物引入2个终止密码子(TAATGA)和EcoRI酶切位点.将PCR产物分别克隆于pGEM-T载体(Promega公司)，再以NdeI和EcoRI酶切

3、，与相应酶切的表达载体pET-20b(Novagen公司)连接，构建成表达质粒pETFd和pETL.上述质粒均经酶切鉴定，并经序列分析证明构建正确.　　12Fd片段链和L链表达将表达质粒pETFd和pETL分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑单菌落接种于2mLLB培养液(羧苄青霉素100mg/L)，37℃振摇过夜.第2日分别取30(L菌液转种于2mLLB培养液(羧苄青霉素100mg/L)中，37℃振荡培养3~4h至A600nm为06~10，加IPTG至终浓度04mmol/L，继续培养3h，以诱导外源程序蛋白的表达

4、.诱导后的菌液6000r/min离心10min，上清加等量2×上样缓冲液，沉淀（菌体）加适量1×上样缓冲液，沸水浴5min，6000g离心1min.取上清SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后观察结果.SDSPAGE凝胶在双薄层扫描仪(Shimadzu,CS930)检测蛋白表达含量.　　13包涵体蛋白的分离和复性取50mL诱导表达的菌液6000r/min离心10min，弃上清，沉淀用5mL50mmol/LTrisHClpH80，2mmol/LEDTA悬浮，加溶菌酶至100mg/L及05mL10mL/LTrit

5、onX100，30℃水浴15min.置冰上，超声波粉碎细胞；4℃，6000g离心15min.上清为可溶性蛋白，取50μL加等量2×上样缓冲液；沉淀为不可溶蛋白，加100μL1×上样缓冲液，SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后观察结果.包涵体蛋白复性参照文献［2］报道的方法进行.　　14免疫印迹取25μL初步纯化浓缩的蛋白溶液与等量的2×上样液混合(加β巯基乙醇),SDSPAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜(NCM)，30g/L脱脂奶封闭，加兔抗人Fab段抗体，再与碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体反应，2BCIPN

6、BT显色.　　15活性检测取25μL初步纯化浓缩的蛋白溶液及其稀释液与等量的碳酸盐缓冲液混合，包被ELISA板孔(每样品包被4孔)，4℃过夜，30g/LBSA封闭，加入适当工作浓度的HRPHBsAg，以底物邻苯二胺显色，测A490nm值，并计算4个孔的平均值.　　2结果　　21Fd段和L链蛋白的表达SDSPAGE检测可见，Fd段和L链表达质粒转达化BL21(DE3)后，均能够表达外源蛋白，其表观分子质量约25ku(Fd)和27ku(L)，并且都是以包涵体形式表达，密度扫描检测Fd段和L链蛋白的表达量分别约为48%和

7、53%.免疫印迹实验显示，两种蛋白均可与抗人Fab段抗体反应，证明为人源抗体.　　22Fab蛋白复性Fd段和L链包涵体经GuHCl溶解后，等量混合加入复性缓冲液中于10℃折叠36h.SDSPAGE检测可见Fd段和L链蛋白在50ku处折叠形成一个新的蛋白，该蛋白带经β巯基乙醇处理则重新消失.薄层扫描显示50ku的复性蛋白占总蛋白的28%.　　23复性蛋白具有结合HBsAg的活性复性的蛋白溶液与酶标HBsAg反应后，A490nm平均为0712，说明表达蛋白复性后对HBsAg有一定抗原结合活性.　　3讨论　　我们将抗HB

8、s抗体的轻链和Fd段基因分别置于pET20b质粒中，转化大肠肝菌后，获得了高效表达，表达产量分别为48%和53%.Fd段和L链蛋白在折叠液中复性，形成的复性蛋白对HBsAg有一定结合活性.说明基因工程抗体大肠杆菌包涵体表达的技术路线是可行的.但是复性效率比较低，需要进一步研究改进复性条件、提高复性比例.　　【参考文献】　　［1］邓宁，粟宽源，王恂章，等.人源