抗a型肉毒毒素人源三结构域抗体的重组设计与表达

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1、!"卷#期微生物学报%&’(!"-&(##$$"年!月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$)*+,’#$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!抗!型肉毒毒素人源三结构域抗体的重组设计与表达王慧荫俊史晶孟露露李佩真（军事医学科学院微生物流行病研究所北京3$$$/3）摘要：以获得的抗)型肉毒毒素人源单链抗体CBD@23/为模板，E1F扩增抗体CBD@基因的重链可变区（%G）和轻链可变区（%!），以重链恒定区（31G3）"H端3#个氨基酸的序列作为连接肽，构建成三结构域抗

2、体分子：%G9连接肽9%!（%GI%!）。重组%GI%!抗体分子在大肠杆菌中得到高效表达，其表达量占菌体总蛋白质的0!J以上。表达的蛋白质在菌内形成包含体，采用镍柱金属鏊合层析法对该包含体进行纯化，得到了纯度高达."J的%GI%!。:KLC)等实验结果显示，重组设计并制备的三结构域抗体蛋白%GI%!不但可以特异识别毒素抗原，具有与原母本单链抗体CBD@相同的抗原特异性，而且具有了更高的相对亲和力和稳定性。关键词：)型肉毒毒素，三结构域抗体，表达，中和活性中图分类号：M/78；F0.#N33文献标识码：)文章编号：$$$398#$.（#$$"）$#9$##09$0O<

3、;,<>的研究结果认为，单链抗体中连接肽序"#"#$试剂：过氧化物酶（GFE）标记的抗G,A95<=列的长短和电荷严重影响抗体的特性。使用不同的抗体购自E,6+B6公司。限制性内切酶及5!O-)连K,>P6+A序列连接抗体可变区构建而成的单链抗体，接酶购自E+&;6=<公司。-,9-5)为EV<+;P6+A序列组装成的单链抗体具有不同的可溶分"#$三结构域抗体设计和重组表达质粒构建泌表达能力（可以相差"倍以上），并具有不同的特以重组质粒*R:T9CBD@作模板，扩增重链可变异抗原

4、结合能力。优化的K,>P6+序列可以提高在尿区（%G），轻链可变区（%!），并合成1G’区的前08个素中的复性单链抗体的稳定性，增加蛋白的可溶性，核苷酸（连接肽基因）。E1F反应条件：.!W3;,>，帮助抗体可变区进行正确折叠。CBD@23/是我们利""W3;,>，/#W3;,>，#"个循环。分别回收扩增片［#Q!］用噬菌体表面展示抗体文库技术筛选获得的一段。以基因融合方式获得%GI%!基因。+#)#和株对)型肉毒毒素特异的人源单链抗体，其在肉毒+),#酶切%GI%!基因，与经同样双酶切的*:5##U中毒被动免疫治疗应用方面具有一定应用前景。本载体连接，转化大肠杆菌

5、OG""，E1F和酶切鉴定重文在母本抗体分子CBD@的基础上，以人重链1G3的组子，即*:59%GI%!表达质粒。"H序列3#个氨基酸，替换母本CBD@中的通用连接肽"#%三结构域抗体在大肠杆菌中的表达（C6+R’S!）0，与重链可变区和轻链可变区重新组装成重组表达质粒*:59%GI%!及空载体*:5##U分新型三结构域抗体，进行重组制备，观察其抗原结合别转化大肠杆菌2K#3（O:0），在K29);*培养基中活性，并在抗体分子的相对亲和力和稳定性方面与0/W培养至-.8$$为$N"，然后加$N";;&’IKLE5R诱母本CBD@进行比较。导表达!V，COC9E)R:

6、分析%GI%!的表达。对比空载体和重组质粒转化子的蛋白条带，观察有无外源"材料和方法基因表达。"#"材料"#&包含体的制备和亲和层析纯化"#"#"载体和菌株：*R:T9CBD@23/为已构建的重提取重组蛋白的包含体，将尿素溶解的包涵体组质粒、人源重组CBD@抗体实验室制备（另文发溶液逐滴滴入复性液（"$;;&’IK5+,A9G1’*G/N#，表），大肠杆菌（!"#$%&’#$’(#)*’）OG""、2K#3（O:0）为3$;;&’IK1SAG，3N";;&’IK1SA，#;;&’IK:O5)，1SA本室保存，表达载体*:5##U为-&@<=6>产品。微溶于水，用前滤

7、去未溶的1SA）中，至终浓度约基金项目：国家“./0项目”（#$$#12"30#$"）作者简介：王慧（3./34），女（满），北京人，助理研究员，博士，从事分子微生物学和免疫学研究。56’：7893$988.!7"0#；:9;<,’：=6>&$3$.?@,*(A,><(B&;收稿日期：#$$!9$79$8，修回日期：#$$!9$.90$55’微生物学报’!卷!"!#$%&，’(静置’)*以上。然后用"+",%%-.$&化子所没有的条带（图,）；这与预测的C3$C"分子/01234+5对样品进行透析。复性蛋白以67869:量相同。目标表达蛋白占菌体蛋白的I’E以上