肢体发育缺陷及胚胎致死相关QTL的精细定位和后肢发育基因表达谱的检测

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1、肢体发育缺陷及胚胎致死相关QTL的精细定位和后肢发育基因表达谱的检测学校代码：10255学号：2150456东华大学硕士学位论文肢体发育缺陷及胚胎致死相关QTL的精细定位和后肢发育基因表达谱的检测FINEMAPPINGOFTHELIMBDEFECTSANDEMBRYONICLETHALITYQTLANDDETECTIONOFTHEGENEEXPRESSIONPROFILESRELATEDTOTHEHINDLIMBSDEVELOPMENT学科专业：生物化学与分子生物学作者姓名：杨柳指导教师：肖君华教授答辩日期：2017年1月18日肢体发育缺陷及胚胎致死相关QTL的精细定位和后肢发育基

2、因表达谱的检测肢体发育缺陷及胚胎致死相关QTL的精细定位和后肢发育基因表达谱的检测摘要哺乳动物的肢体发育涉及细胞增殖、分化、迁徙和凋亡，同源异形盒基因（HOX）、音猬因子（Sonichedgehog，SHH）、成纤维生长因子（fibroblastgrowthfactor，FGF）和WNT信号通路在其中发挥重要作用。肢体发育初期的肢芽主要由顶外胚层嵴（AER），渐进带（PZ）和极性活化区（ZPA）三部分组成。AER区是肢体生长的主要信号中心，表达一些FGF家族成员基因，如Fgf4和Fgf8。PZ区为AER内侧有着旺盛分裂能力的间质细胞区域，主要由Hoxa基因簇和Hoxd基因簇调控。Z

3、PA区存在于肢芽的后侧，SHH和骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMPs）等基因在其中起到表达调控作用。也有文献报道，肢体发育异常也会并发不孕不育症。由于本实验后肢性状有不完全的外显率，但母体相关的胚胎致死表型十分稳定，因此本实验以胚胎致死的表型为QTL的定位标准。首先，将性状小鼠与C57BL/6品系小鼠杂交，建立F2代同类系小鼠实验动物模型。在8号染色体上的相关区段，选择平均分布的4个SNP位点，再通过使用聚合酶链式反应-连接酶检测法（PCR-LDR）分型技术，对小鼠进行基因分型。通过对相关QTL精细定位后，本实验成功地将之前粗略定位的小鼠8号染色体

4、上的10Mb缩短到2.5Mb（68.3-70.8Mb）。并通过MGI小鼠基因数据库上相关QTL区段的基因信肢体发育缺陷及胚胎致死相关QTL的精细定位和后肢发育基因表达谱的检测息与小鼠二代测序信息比对，初步筛选出10个候选基因。接着，本实验为研究小鼠胚胎后肢发育阶段（E10.5,E11.5,E12.5,E13.5）相关基因（主要为Hox基因家族）与候选基因的共表达情况，挑选了一个候选基因Pbx4，与Hox基因家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Shh等43个与肢体发育相关的基因建立了表达谱，并建立了qPCRarray技术手段，用于后续实验的大量候选基因研究工作。首先，选取了Hox

5、基因家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Pbx4、Shh等44个与肢体发育相关的基因为检测基因，选取β-actin和Gapdh为看家基因，同时还设置了基因阴性对照组和样品阴性对照组，然后以加热烘干的方法将基因引物固定在PCR板上，加入样品和qPCR反应物，进行实时定量PCR反应。然后，对建立的qPCRarray进行了评估工作，通过样品梯度稀释的方法检验了其扩增效率；统计所有表达谱基因的Ct值标准差，评估了该方案的重复性；通过qPCRarray的溶解曲线和PCR产物的琼脂糖凝胶电泳证明了该技术手段特异性强的优点。通过已建立的qPCRarray检测了C57BL/6（简称B6）品系小

6、鼠胚胎后肢发育时期Hox家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Pbx4、Shh等基因的表达差异。以E10.5为对照，检测出在后肢发育时期基因有着两种共表达模式，即Hoxb6、Hoxb8、Hoxc8、Hoxc9、Hoxc10、Hoxd9、Shh、Hoxc9、Hoxc10、Hoxc11、Hoxd9、Hoxd12、Fgf8和Pitx1等基因的相对表达量呈先上调后下调的表达模式；Hoxa11、Hoxa13、Hoxc12、Hoxc13、Hoxd13等基因表达出现下调，候选基因Pbx4的相对表达水肢体发育缺陷及胚胎致死相关QTL的精细定位和后肢发育基因表达谱的检测平与这种共表达模式相似。另外

7、也有少部分Hox基因在小鼠后肢发育时期表达水平无明显变化。综上所述，本实验第一部分首先对肢体发育缺陷及胚胎致死的小鼠进行了染色体上相关QTL的精细定位，初步筛选了挑选候选基因。第二部分实验为研究小鼠胚胎时期后肢发育相关基因的表达状况，建立了高效稳定、特异性强且重复性好的qPCRarray基因检测方案，检测结果描述了在C57BL/6品系小鼠胚胎肢体发育期Hox基因家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Pbx4、Shh等基因的相对表达差异，建立了后肢发育基因表达谱，为肢