成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞体外定向诱导分化为胰岛样细胞.doc

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1、成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞体外定向诱导分化为胰岛样细胞作者：房佰俊，宋永平，曹莹，林全德，买玲【摘要】目的体外定向诱导成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞分化。方法首先将成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞培养在含适当浓度的B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)的培养基中诱导，接着更换诱导培养基，用含适当浓度的β细胞调节素、尼克酰胺等高糖无血清培养基诱导细胞向胰岛样细胞分化。用RTPCR法检测诱导前后nestin、ngn3、胰岛素启动子

2、因子1(IPF1)、胰岛素及胰高血糖素基因的表达；免疫荧光染色法检测诱导前后nestin、胰岛素及胰高血糖素的表达；放射免疫分析法检测诱导前后细胞分泌胰岛素情况。结果成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞经第一阶段的诱导后可分化成nestin阳性的祖细胞，继续诱导6d后变圆的细胞逐渐增多，并最终聚集成团。免疫荧光实验证明经诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等内分泌激素；放免分析结果表明，诱导的胰岛样细胞团可以分泌胰岛素。结论成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞具有胰腺干祖细胞的固有特征

3、，极有可能作为种子细胞用糖尿病的细胞治疗。【关键词】干细胞；胰岛；脂肪糖尿病是严重危害人类健康的常见多发病，目前临床对Ⅰ型糖尿病所用的胰岛素注射疗法并不能令人满意。近几年，经肝内门静脉植入胰岛细胞治疗糖尿病取得了一些疗效[1]，但遗憾的是，胰岛细胞移植仍面临诸多难题，如供者来源不足及严重的免疫排斥反应等。因此，积极寻找新的胰岛细胞资源已成为当务之急。胚胎干细胞具有发育的全能性，可自发分化或经诱导分化为胰岛细胞[23]。另外，有学者[4]对胰管上皮细胞及胰岛细胞进行培养，诱导nestin阳性的胰腺干细胞分化为内

4、分泌腺细胞。可见，胚胎干细胞和胰腺干细胞均可成为糖尿病细胞治疗的种子细胞。但是，它们又存在伦理学上的争论及取材不便等问题，从而限制了临床运用。我们前期的研究结果提示，成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞几乎具有类似于胚胎干细胞的全能性[5]。因此，在本实验中，我们探索了诱导成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞分化的条件，以为用细胞治疗糖尿病提供合适的种子细胞。　　1材料与方法　　1.1成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞的分离和培养[5]　　抽取适量皮下脂肪组织，剪碎，用D

5、Hanks液洗去血细胞，20mg/LⅡ型胶原酶消化2h，洗掉胶原酶，用FicollPaque(1.077mg/L)分离液分离得到单个核细胞后，用CD45及GlyA磁珠(德国Miltenyi5Biotec公司)分选去除CD45+及GlyA+细胞，将阴性选择所得细胞接种在96孔细胞培养板中(每孔1个细胞)。96孔板预先以ECM胶[含5g/L骨形态发生蛋白4(bonemorphogeneticprotein4,BMP4，美国Sigma公司)，30μg/L干细胞因子(stemcellfactor，SCF，美国Si

6、gma公司)及3%(体积分数)胎牛血清(英国Gibco公司)]铺板。20d后，挑取单克隆细胞，扩增备用。扩增培养液成分为：40%(体积分数)MCDB(英国Gibco公司)，56%(体积分数)DF12(英国Gibco公司)，4%(体积分数)胎牛血清(英国Gibco公司)，20μg/L白细胞介素6(interleukin6，IL6，美国Sigma公司)。　　1.2体外诱导成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞团分化　　取成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞以2×105/mL密度接种于6

7、孔板中，每孔加3mL诱导液1[含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF，美国PeproTech公司)，10μg/L表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF，美国PeproTech公司)及0.2g/LB27的IMDM(英国Gibco公司)培养液]，经诱导液1培养6d后，去除旧培养液，用PBS缓冲液洗细胞，添加诱导液2[含10μg/Lβ细胞调节素，10μg/L肝细胞生长因子(美国R&DSystemsInc公司)，10μg/

8、L活化素(ActivinA，美国R＆DSystems公司)和10mmoL/L尼克酰胺(美国Sigma公司)及0.2g/LB27的IMDM培养液]，继续培养6d。　　1.3RTPCR鉴定基因的表达　　用Trizol试剂(Gibco)提取成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞及诱导6d或12d后细胞的总RNA,反转录合成cDNA，用PCR鉴定nestin、ngn3(neurogen