抗原致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究.doc

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1、抗原致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究作者：罗道升，戴宇平，张珑涓，赵继宗，郑伏甫罗彬【摘要】【目的】探讨肾癌细胞抗原致敏白介素-12（IL-12）基因修饰的树突状细胞（DC）体外诱导、激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫杀伤肾癌细胞的效能及相关免疫机制。【方法】采用重组逆转录病毒介导IL-12基因修饰人外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC；超声细胞破碎法提取肾癌细胞粗提抗原（Ag）致敏经IL-12转染的DC；ELISA法检测各组DCs和各组CTLs上清中IL-12、IFN-γ因子的分泌水平；流式细胞仪(FACS)分析各组D

2、Cs表面CD83、CD86、HLA-DR的表达；MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖的能力及CTL免疫杀伤肾癌细胞的效能；统计学分析比较各组间的差异。【结果】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC高表达CD83和CD86分子分别为(65.9%±3.1%,92.8%±3.4%），分泌高水平IL-12(279.6±1.7)pg/mL及IFN-γ(892±31)pg/mL，刺激同源T淋巴细胞增殖明显，诱导激活的CTL上清中IFN-γ水平(1146±31)pg/mL显著高于对照组；CTL对肾癌细胞有强大的杀伤作用，显著高于各对照组。【结论】经IL-12基因

3、修饰和抗原致敏后的DC能有效地诱导CTL特异性抗肿瘤免疫应答。其机制可能与IL-12基因修饰和抗原致敏活化了DC抗原提呈第二信号，促进了DC高分泌IL-12因子，激活了T淋巴细胞致使CTL分泌IFN-γ的能力增强密切相关。【关键词】肾细胞癌；肿瘤抗原；白细胞介素-12；树突状细胞；肿瘤疫苗树突状细胞(dendriticcell,DC)是体内功能最强的抗原提呈细胞，它能直接诱导、增殖、活化T淋巴细胞，产生特异性免疫应答[1]，在启动抗肿瘤免疫反应中起关键作用[2]。研究表明癌组织中DC的数量是肿瘤预后的重要参数之一[3]，研究也发现荷瘤宿主体内存在一定

4、数量的DC，但DC的数量、形态、表型异常，免疫能力差[4]。因此，构建一种以DC为基础的瘤苗，对DC进行一定的修饰，籍以增强DC的免疫功能将能增强肿瘤患者的免疫功能。本研究采用786-0肾癌细胞株粗提抗原致敏和IL-12基因转染DC，制备成DC瘤苗，观察其体外诱导自体T淋巴细胞产生特异性抗肾癌免疫的效能，并对结果进行分析。1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂RPMI-1640购自Gibco公司；特优级胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司；重组人粒细胞-巨噬细胞集落群体刺激因子(rhGM-CSF),重组人白细胞介素-4(rhIL-4)，重组人白

5、细胞介素-2(rhIL-2)购自Peprotech公司；人IL-12ｐ70和IFN-γELISA检测试剂盒购自晶美公司；FITC标记的鼠抗人HLA-DR、CD836、CD86抗体均为PharMingen及caltag公司产品；淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque）为上海试剂二厂；流式细胞仪为美国BECKMAN-COULTER(贝克曼-库尔特)公司产品；酶标仪为荷兰MULTISKANMK3公司产品；超声细胞破碎仪为美国SONICS&MATEIALS公司产品。1.1.2病毒载体和细胞系PA317-IL-12重组逆转录病毒由北京大学深圳医院

6、李宝金博士后惠赠，其病毒滴度为1.1×105～1.4×105CFU/mL；786-0肾癌细胞株购自上海中国科学院细胞库。1.2实验分组设计1.2.1DC分组①实验组：抗原致敏IL-12基因修饰DC组(DCIL-12+Ag)；②对照组：抗原致敏DC组(DCAg)；③对照组：IL-12基因修饰DC组(DCIL-12)；④DC对照组(DCnaive)。各组样本数均为6。1.2.2CTL分组①实验组：抗原致敏IL-12基因修饰DC刺激组(CTLDC-IL-12+Ag)；②对照组：抗原致敏DC刺激组(CTLDC+Ag)；③对照组：IL-12基因修饰DC刺激组(

7、CTLDC-IL-12)；④对照组：DC刺激组(CTLDC-naive)；⑤T细胞对照组（Tnaive）。各组样本数均为6。1.3方法1.3.1树突状细胞的体外诱导和培养外周血来自临床血库新鲜全血300mL，每次取50mL，用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞(PBMC)，用无钙镁PBS液（pH7.2）洗2～3遍，调整细胞浓度为106cells/mL，接种在两6孔板上贴壁，每孔加2mL，4h后吸去悬浮的淋巴细胞(冻存备后用)，留下贴壁细胞(DC前体细胞)加入含GM-CSF（1000U/mL）、IL-4（500u/mL）和10%FBS的RPMI-164

8、0完全培养液，在37℃、5%CO2孵箱中培养，每2d～3d更换培养液，培养7d～9d收集DC和上清。1.3.