BDELISPOT技术—医学讲解课件

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1、BDELISPOT—单细胞分析技术中山大学基础医学院免疫教研室吴长有BDELISPOT简介BDELISPOT是在ELISA技术的基础上建立的体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术。由于其可在单细胞水平检测和计数特异性分泌抗体和细胞因子的细胞，并具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用。ELISPOT技术的过去ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky等人率先在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。早期ELISPOT的分析条件

2、不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题无法解决。直到1996年PVDF薄膜的应用（Forsthuberetal.,Science,1996），才解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高ELISPOTCytokine分析的敏感度。ELISPOT技术的现在1996年以来随着抗体制备、PVDF膜等技术改良，ELISPOT

3、分析技术已经逐渐达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特异性T细胞的体外检测技术。ELISPOT未来展望ELISPOT技术已经达到标准化、规范化的要求，并被广泛地应用在多项领域，包括监视癌症病人接受免疫疗程时的反应(Lewis,2000andJanetzki,2000)，以及感染性疾病(Moss,2000,Rahman,2000,Rowland-Jones,1998,Herr,1997andLechner,2000)、肿瘤(Nagorsen,2000)、或自体免疫病人体内的一个特定的免疫反应形式(Pel

4、frey,2000)。ELISPOT技术同时也在数个疫苗效价评估人体试验中，被当成重要的指标之一。2003年1月，世界卫生组织通过与大陆北京性艾中心合作，应用ELISPOT技术来监测HIV疫苗研究免疫应答反应技术，该计划是首次利用ELISPOT技术对亚洲国家从事HIV疫苗研究和临床试验的有关研究。我们期待未来此一技术能在我国免疫学界得到广泛地应用。ELISPOT与ELISA的比较ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可

5、溶性蛋白，它们最大的不同在于：1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。2.ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过北京赛智创业生产的ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）3.由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细

6、胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。4.捕获抗体为BD生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。BDELISPOT技术优势单细胞水平检测分泌到的胞外细胞因子观察活细胞应答（动态）而非检测培养上清、血清、血浆、裂解液（静态）结果以斑点显示,能计数效应细胞，分析效应分子产生频率＃ofSpots:cellnumbers/frequencysizeofSpots:relativeamountproduced高灵敏度最低至1：100万细胞精度的活体外频率测量。这种分辨率

7、已经远远超过使用细胞内细胞因子的四聚物染色和ELISA法测量的精度。因为抗原特异性T细胞在体外都是典型性的低频率。高产量,大容量T细胞分析成为可行。只需要少量样本即可进行检测分析。淋巴细胞在ELISPOT分析后依然存活。这使得分析之后可以用于进行增殖，用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能。低温储藏后的淋巴细胞可以用于检测，而不会丢失其功能。BDELISPOT应用移植研究疫苗开发-亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响Th0/Th1/Th2细胞转换分析自体免疫研究–免疫调节及免疫治疗研究癌症研究-肿瘤反

8、应T细胞作用过敏机制探讨–IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与过敏机制之细胞因子研究传染疾病研究体液免疫研究–B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究BDELISPOT原理ELISPOT实验设计是在96微孔培养板底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodiumazide、内毒素endotoxin）的单株抗体。静脉血PBMC经适当分离处理后分配到微孔上，再接受适当的抗原刺激，并将