牛羊乳酪蛋白抗原表位鉴定及热处理对其抗原性的影响

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1、论文分类号：〗学校代码：１０７０８学号：１５０４０１７龜换蚤＃技ＡｆＳＨＡＡＮＸＩＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ硕士学位论文Ｔ＇ｈｅｓｉｓｆｏｒＭａｓｔｅｒｓＤｅｇｒｅｅ讓牛羊乳酿蛋白抗原表位鉴定及热处理对其Ｊ了！““亀ＷＪ―一■Ｉ论文答辩日期：２０１８年５月ｍｉ学位授予单位：陕酿技大ＢＩＩＩＩｊ］＇申请工学硕士学位论文论文题目：牛羊乳酪蛋白抗原表位鉴定及热处理对其抗原性的影响学科门类：工学一级学科：食品科学与工程培养单位：食品与生

2、物工程学院硕士生：韩波导师：宋宏新教授薛海燕副教授2018年5月IdentificationofbovineandgoatmilkcaseinantigenepitopesandeffectsofheattreatmentontheirantigenicityAThesis(orDissertation)SubmittedtoShaanxiUniversityofScienceandTechnologyinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofEngineeringScien

3、ceByBoHanSupervisor：Prof.Hong-xinSongA.Prof.Hai-yanXueMay2018牛羊乳酪蛋白抗原表位鉴定及热处理对其抗原性的影响摘要牛乳虽营养丰富，但也是引起人体过敏的八大类食物之一，蛋白质是乳品中主要的过敏原。羊乳同样具有较高的营养价值，有人认为羊乳的致敏性较牛乳低，但是，羊乳是否可代替牛乳，作为牛乳过敏者的乳源，学术领域说辞不一，值得探讨研究。本研究从致敏机理出发，利用生物学软件对牛羊乳主要过敏原酪蛋白进行抗原表位预测及免疫学验证；利用Caco-2细胞模型探讨抗原表位肽是否能以完整的形态被肠道上皮细胞吸收

4、，为后续研究合成抗原表位肽能否引起机体过敏反应提供参考。并通过不同条件的热处理，探究牛羊乳酪蛋白抗原性和结构之间的变化规律，有目的的降低其致敏性，为低敏性和无致敏性牛羊乳的开发奠定一定的理论基础。主要研究结果如下：（1）牛羊乳酪蛋白抗原表位预测及免疫学检测验证。利用SOPMA、theBepiPred1.0网络服务器和DNASTAR三种生物信息学软件成功预测出了牛乳αs1-CN可能抗原表位肽段是99~102148~149189~208；牛乳αs2-CN可能抗原表位肽段是72~75；羊乳αs1-CN可能抗原表位肽段是26~31140~142205~208

5、，羊乳αs2-CN可能抗原表位肽段是210~215。结果表明：较牛乳αs1-CN相比，羊乳虽含有少量的αs1-CN但它同样具有较多区域的抗原表位，且二者存在一定的包含重叠关系。而牛羊乳αs2-CN均含有少量的抗原表位。选取差异较大的抗原表位肽段采用固相合成法合成，并挑选来源于牛乳α-酪蛋白的抗原表位肽P-1038（TDAPSFSDIPNPIGSENSEK），来源于羊乳α-酪蛋白的抗原表位肽P-1037（LSPEVP），与KLH连接制备成完全抗原，通过动物实验验证该抗原表位的免疫性。结果表明，以合成肽-KLH偶联物作为抗原，(P-1037-KLH)-I

6、gG的效价和(P-1038-KLH)-IgG的效价均达到1∶204800，说明免疫原性很强；而以单纯的合成抗原表位肽作为抗原，2种肽段对应血清的效价分别达到1∶12800和1∶6400，结果表明：合成抗原表位肽虽为小分子物质，但实验数据显示具有一定的免疫性。通过交叉实验检测得出(P-1037-KLH)-IgG的特异性高于(P-1038-KLH)-IgG。（2）合成抗原表位肽在Caco-2细胞的转运吸收研究。Caco-2单层细胞培养4-10d时为细胞生长对数期，可进行传代培养；10d以后融合率达到I90%，细胞开始分化，碱性磷酸酶活性不断增大，20d时

7、活性达到最大且此时的TEER值增至506Ω·cm2，荧光黄渗透系数P-8app值为5.0334×10，综合以上指标，建模成功。采用旁路转运的方式对合成抗原表位肽进行Caco-2跨膜转运实验，结果表明：来源于牛乳α-酪蛋白的抗原表位肽P-1038（TDAPSFSDIPNPIGSENSEK）、P-1039（EDVP）和P-1041（SSEE）的透过率为1%、14%和16%；来源于羊乳α-酪蛋白的抗原表位肽P-1037（LSPEVP）、P-1040（EGN）和P-1042（TQPKTN）的透过率为3%、32%和2%，透过率与片段大小有关。来自牛羊乳酪蛋白的

8、6条抗原表位肽段，在肠Caco-2细胞的转运中存在部分水解。透过片段及水解后的小分子肽段是否具有致敏性引起机