糖基化修饰对大豆蛋白过敏原抗原性的影响研究-硕士论文

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4、ertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：ZhuTingweiSupervisor：Prof.ChenFushengAssociateProf.BuGuanhaoCollegeofFoodScienceandTechnologyHenanUniversityofTechnology,Zhengzhou,China摘要大豆是优质的植物蛋白资源，同时也是八大食物过敏原之一；糖基化改性是降低蛋白质过敏原的有效方法之一。因此，研究糖基化对大豆蛋白过敏原进行改性具有重要的现

5、实意义。本文制备了兔抗大豆球蛋白和兔抗β-伴大豆球蛋白的多克隆抗体，优化了间接ELISA方法的最佳反应条件：大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白抗原包被浓度分别为0.025μg/mL和0.3μg/mL，均4℃包被过夜。一抗血清的最适稀释度均为1:3200，抗原抗体最佳反应条件37℃孵育1h，酶标二抗的最佳稀释度均为1:10000；板内误差分别为3.82%和2.19%，板间误差分别为10.22%和9.61%，均在允许的误差范围之内；其检测线范围分别为0.01μg/mL~0.05μg/mL和0.1μg/mL~2.0μg/mL。

6、结果表明所建方法具有良好的重复性和准确度，可用于检测大豆蛋白糖基化产物的抗原性。选择葡萄糖、乳糖、葡聚糖为糖基供体，采用JMP软件研究不同条件下糖基化产物的抗原性变化规律。结果表明，随反应时间的增加，整体上糖基化产物抗原性逐渐降低。大豆分离蛋白-葡聚糖复合物在蛋白与糖质量比3:1、反应温度60℃、反应9d时，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原抑制率分别降低了30%和20%；大豆分离蛋白-乳糖复合物在蛋白与糖质量比4:1、反应温度60℃、反应96h时，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原抑制率分别降低了50%和30%；

7、大豆分离蛋白-葡萄糖复合物在蛋白与糖质量比3:1、反应温度55℃、反应72h时，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原抑制率分别降低了70%和25%。在三种糖的糖基化改性中，葡萄糖改性效果最好。对抗原性降低效果较好的三种糖基复合物于不同反应时间进行糖基化程度测定，并从不同的角度研究了糖基化反应程度的变化规律。结果发现随反应时间的增加，糖基化产物颜色加深，且游离氨基含量降低，说明大豆蛋白与不同的糖均发生了不同程度的反应。SDS-PAGE分析结果说明糖基化反应的发生，并伴随大分子物质的生成。结果证明，抗原性降低程度与糖基化

8、反应程度二者并不成线性关系。紫外光谱研究发现糖链的引入，易使蛋白质肽链展开暴露内部氨基酸，其助色基团与糖链中羟基共轭，引起吸收带蓝移；荧光光谱中糖基化产物强度增加，蛋白质暴露更多的疏水区域，具有更加紧凑的三级结构；红外光谱中糖链的引入，使蛋白质分子展开，二级结构中β-转角和无规则卷曲结构含量的降低，影响了大豆蛋白中的β-伴大豆球蛋白的α亚基的抗原表位。从而可