real time pcr操作步骤：从采样到数据处理

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1、RealtimePCR操作步骤：从采样到数据处理1.采样：1.1采样前的准备：DEPC水，灭菌手术刀剪，75%酒精，2mL无RNA酶离心管，2个盛有DEPC水的烧杯，一个用于冲洗样品，一个用于放置手术刀剪，以减少外界污染。1.2采样过程中的注意事项：采样人员需带好口罩和手套，并且尽量少讲话。当鸡放血致死后，立即解剖，并优先取RNA试验用样品。取样量约100mg左右（根据RNA提取方法不同可改变取样量），尽量保证每管取样大小和部位接近一致（可事先取些样品，有个大概的标准即可）。RNA样品采集于离心管中，立即投入液氮（或者RN

2、A保存液中）冻存，最后统一转入-70℃冰箱。根据实验条件选择RNA样品的保存方式，优先选择液氮保存。建议:如果直接投入液氮保存，离心管盖子要盖严，以免液氮渗入管中，导致离心管在转入-70℃冰箱时管盖崩开使样品损失。2.总RNA提取提取组织和细胞总RNA推荐使用Trizol法。2.1Trizol提取总RNA的操作步骤以下操作需在超净台中进行，超净台使用前需用75%酒精擦拭台面，紫外灯照射半小时后，打开风机排除臭氧，减少对实验人员的伤害。此外，要提前制冰备用。1)每50-100mg样品加1mlTrizol，使用高通量研磨仪研磨

3、30s。2)研磨后样品放置5min，4℃12000g离心10min，上清液转移到另一个1.5ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）。3)加入200µL氯仿，用力摇晃15s，室温放置5min。4)4℃12000g离心15min，上清液转移至另一个1.5ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）。5)加入500µL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，沉淀RNA。6)4℃12000g离心10min，弃上清。7)加入1ml75%乙醇（DEPC水配制），用移液器反复吸打乙醇，洗涤RNA沉淀。8)4℃7500g离心5min，弃去乙醇。9

4、)用微型离心机将EP管内壁上的乙醇甩至管底，用10μL枪头吸出，打开盖子置于超净台内晾十几秒，但不能让RNA全部干透，内壁上没有水珠即可。10)根据RNA的量加入无Rnase水60-120μL，轻弹管壁，充分溶解RNA，混匀后分装出少许用于测定RNA浓度以及用于电泳检测。locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(Wuzhensaidi

5、nformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame11）测定OD260/OD280值以及RNA浓度。取1μLRNA用DEPC水稀释100倍，紫外分光光度计下读取RNA浓度值和OD260/OD280值（1.9-2.0之间表示RNA纯度较好，小于1.8说明含蛋白质、杂质较多，大于2.2表示RNA降解）。建议：建议使用200μL的枪头转移上清液，可减少蛋白污染。可用柱式RNA提取试剂盒，推荐TAKARA公司的产品，提取速度快，无毒性，质

6、量很好，价格比较高。Trizol推荐invitrogen公司的产品，直接从公司订购要1200元/100mL，从科昊泽订只要750元/100mL，所以可以多咨询比对代购的价格。1.反转录cDNA多用转录试剂盒进行cDNA反转录，按照对应说明书操作即可。反转录过程需在超净台中进行。Invitrogen和TAKARA的cDNA反转录试剂盒的质量很高。Invitrogen的试剂盒步骤稍微繁琐，但最后得到的终产物量多。TAKARA的转录速度快，但终产物量少。我所用过的产品Invitrogen的货号是C28025-032（50次反应）

7、，TAKARA的是PrimeScriptRTMasterMixPerfectRealTime，货号DRR036A（200次反应），和之后用的荧光定量试剂盒可以搭配使用。建议:cDNA体系中RNA模板的浓度要一致，可用体系要求模板浓度和所测出的RNA浓度计算所需加模板量和无RNA酶水的量。推荐用excel计算，并打出表格，参照表格进行加样。2.引物PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR产物的特异性及成功与否。根据试验选择引物。做Real-timePCR的引物

8、片段最好在200bp以下。可通过查找相关英文文献来选择引物，文献中会标注目的基因的引物、引物片段长度和在NCBI上的编号。如果引物查找不到，也可自行设计，在NCBI上查找所需基因，得到基因的碱基序列，用DNAMAN设计。确定了引物序列后，交由公司订购，获得引物后需要验证是否能用。建议：实验室所用引物主要