real time pcr实验流程

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1、RealtimePCR实验流程一、总RNA提取Ⅰ前期准备1.实验器具的处理：塑料制品（枪头、EP管等）——DEPC水浸泡过夜，高压蒸汽灭菌，烘干；金属、玻璃制品——锡箔纸包裹，180℃烘烤4h。2.DEPC水：1000mL双蒸水中加1mLDEPC，1000mL容量瓶中颠倒混匀几分钟，静置4h后备用。用来浸泡枪头、EP管等。3.75%乙醇（现用现配）：用无水乙醇和DEPC水（上述DEPC水高压后，即RNasefreewater）配制，然后放于-20℃备用。4.异丙醇、氯仿：最好是新打开的或RNA提取专用，放入棕色瓶。注意

2、：RNA提取及逆转录成功的关键是防止RNase污染，整个流程所用器具应均为RNasefree，操作过程中实验者穿白大褂，戴口罩、手套。Ⅱ实验步骤1.RNA提取流程液氮研磨组织↓100mg加1mLTRIzol↓颠倒混匀，室温5min↓加氯仿0.2mL（按总体积的1/5）↓用力摇晃，室温5min↓4℃，离心12000rmp，15min↓转上层水相，加0.5mL异丙醇，室温10min↓4℃，离心12000rmp，10min↓弃上清，加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1mL↓4℃离心7500rmp，5min↓弃上清

3、，干燥约5min（不能完全干燥）↓溶于DEPC水中（20μL）↓立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录2.RNA纯度及完整性测定：（1）分光光度计测定纯度：在98μLRNasefreeH2O中加入2μL待测RNA溶液并混匀，经过核酸蛋白检测仪测定其OD值，若OD260/OD280在1.8～2.0，说明所提RNA纯度较高。RNA浓度（ng/μL）＝OD260×40×稀释倍数/1000。（2）琼脂糖凝胶电泳测定完整性：将2.5μL所提RNA与上样缓冲液混匀后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，120V20min后上凝胶成

4、像系统观察并拍照。若5s带不明显且18s、28s条带清晰、明亮，28s带的宽度和亮度约为18s带的2倍（如图1）说明RNA完整性较好、无降解，所提总RNA可以用于逆转录。图1RNA电泳图二、去除基因组DNA按如下体系加样：RNA1～2μg10×reactionbuffer1μLDNaseⅠ1～2μLRNasefreeH2Oupto9μL冰上加样后混匀，短暂离心收集溶液到管底，在PCR仪上按以下条件进行反应：37℃30min。为防止加热过程中RNA的水解，反应结束后加入1μL25mMEDTA，65℃保温10min。立即以

5、制备好的RNA为模板进行反转录反应。三、逆转录反应按如下体系加样：5×Buffer2μLRTenzymemix0.5μLOligodTprimer0.5μLRandom6mers2μLtotalRNA<500ngRNasefreeH2Oupto10μL冰上加样后，短暂离心收集溶液到管底，在PCR仪上按以下条件进行反转录反应：37℃15min，85℃5sec。反应结束后-20℃保存或立即进行realtimePCR。四、realtimePCR1引物设计通过检索，从Genbank数据库中获取目的基因mRNA序列，引物由宝生物

6、工程（大连）有限公司设计并合成。2扩增效率一致性的确认利用ΔΔCt法进行相对定量的前提是目的基因和内参基因（β-actin）的扩增效率一致。将CON组大鼠脂肪组织总RNA逆转录成cDNA，对样品进行梯度稀释（5倍），得到5～6个浓度的模板。以梯度稀释的样品为模板，按如下体系加样：SYBRPremixExTaqⅡ10μLprimermix（10μM）1.6μLcDNA1.5μLdH2O6.9μL冰上加样后，短暂离心收集溶液到管底，在realtimePCR仪上按照试剂盒推荐条件进行realtimePCR，绘制标准曲线，计算

7、扩增效率，确认各目的基因和内参基因的扩增效率是否一致（接近100%且差距<5%）。两步法realtimePCR扩增标准程序：Stage1：预变性，Repeat：1，95℃30secStage2：PCR反应，Repeat：40，95℃5sec，60℃30secStage3：Dissociation3反应体系和退火温度的优化若扩增效率不一致，设置60℃、61℃、62℃、63℃四个温度梯度，对退火温度进行优化。融解曲线为基底窄而峰高的单峰时，选择Ct值最小的温度作为最佳退火温度。4RealtimePCR以实验大鼠脂肪组织cD

8、NA为模板，每个样本重复三次。每次实验另设空白对照管（dH2O代替模板），验证有无污染的发生。按如下体系加样：SYBRPremixExTaqⅡ10μLprimermix（10μM）1.6μLcDNA1.5μLdH2O6.9μL冰上加样后，短暂离心收集溶液到管底，在realtimePCR仪上按以下条件进行反应。两步法realtime