Real-time PCR实验步骤(自己总结)

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1、Real-timePCR实验步骤北京协和医学院阜外心血管病医院心外科心血管病国家重点实验室吴益和实验中必须坚持的一些好习惯总的注意事项：1.加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均2.移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性3.所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因一、防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先

2、用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活

3、性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、

4、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染：RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理动植物总RNA提取-Trizol法T

5、rizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1、将组织在液N中磨成粉末后，再以5

6、0-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总6体积不能超过所用Trizol体积的10%；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10×10个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2、将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30℃下放置5分钟；然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；3、取上层水相（离心后，混合物将分离为底

7、层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%）于一新的离心管，按每1mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温（15℃～30℃）放置10分钟，12000g（2℃～8℃）离心10分钟。【如果希望分离DNA或蛋白质，保留中层和下层酚-氯仿相，有机相能保存在4°C一夜】4、弃去上清液（RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁），按每1mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇进行洗涤，涡旋混匀，4℃下7500g离心5

8、分钟【RNA能够在–20°C保存在75%乙醇中至少1年，4°C保存至少1周】5、小心弃去上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会使RNA失去溶解性，导致A260/280ratio<1.6。6、加适量Rnase-freewater溶解RNA沉淀，用枪头反复吸取混匀，55–60℃水浴10-15min。进