real time PCR 操作手册

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1、Real-timePCR检测(protocol)4/4实验流程描述：收集生长状态良好的目的细胞，提取RNA，并反转录成cDNA采用realtimePCR方法检测目的基因的表达情况。实验材料：1．主要试剂REAGENTSCOMPANYCat.No.TrizolInvitrogen15596-026M-MLV逆转录酶promegaM1705dNTPspromegaU1240oligodT上海生工B0205RnaseInhibitorpromegaN2115Primer(R&F)上海吉凯SYBRMasterM

2、ixtureTAKARADRR041B2．主要仪器EQUIPMENTSCOMPANYCat.NoNanodrop分光光度计Thermo2000/2000C稳压电泳仪上海天能RealtimePCR仪器TAKARA公司TP800实验步骤：1总RNA抽提（根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行）1)收集细胞，2000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mlTrizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5mlEP管中；2)每管加入200μl氯仿，用手上下颠倒eppendo

3、rf管15s，室温静置10min；3)4℃，12800rpm，离心10min；4)吸取上层液体移至新的1.5mlEP管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10min；5)4℃，12800rpm离心10min后，弃上清；4/46)加入1ml75%乙醇（用DEPC水新鲜配制），洗涤沉淀；7)4℃，11800rpm离心5min，弃去大部分上清；8)4℃，11800rpm离心5min，弃去上清；室温干燥；9)待RNA沉淀基本透明时，加入RNase-free水（加入体积视RNA沉淀量而定）至完全溶解，Nano

4、drop2000/2000C分光光度计分析测定所抽提RNA的浓度及质量。2RNA逆转录获得cDNA（根据Promega公司M-MLV操作说明书进行）实验所需耗材均购自Axygen，具体步骤如下：1)将1μlOligodT(0.5μg/μl)和2.0μgTotalRNA加入到PCR小管中，补充RNase-FreeH2O至10ul；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使OligodT和模板退火；2)按下表的比例配制反应体系（冰上进行），混匀，短暂离心；试剂每管加入量5×RTbuf

5、fer4μl10mMdNTPs2μlRnasin（40U/ul）0.4μlM-MLV-RTase（200U/ul）1μlRNase-FreeH2O2.6μl注：dNTPs是dATP,dCTP,dGTP,dTTP的混合，浓度为10mM3)上述体系在42℃水浴反应1h，然后在70℃水浴10min使RT酶失活；4)将得到的RT产物--cDNA置于-80℃保存备用。3Real-timePCR检测1)按下列比例配置反应体系：试剂每管加入量SYBRpremixextaq:10.0μl上游引物（2.5μM）0.5μl

6、下游引物（2.5μM）0.5μlcDNA1.0μl4/4RNase-FreeH2O8.0μl2)两步法进行Real-TimePCR，并制作熔解曲线，程序如下：4．数据分析见实验报告4/4