snp-cnv分型-qpcr-甲基化

《snp-cnv分型-qpcr-甲基化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、SNP分型技术1.连接酶检测反应(LDR)分型方法技术原理：主要应用连接酶检测反应(ligasedetectionreaction，LDR)技术。即在TaqDNA连接酶的作用下，当左右两条寡核苷酸探针与目的DNA序列完全互补，并且两条探针之间没有空隙时才能发生连接反应，否则连接反应不能进行，最后通过荧光扫描片段长度，实现对SNP位点的检测。2.多重SNaPshotSNP分型方法技术原理：SNaPshotSNP分型是一种以单碱基延伸原理为基础，同时利用多重PCR对多个已知SNP位点进行遗传分型的方法。在一个含有测序酶，四种荧光

2、标记的ddNTP，紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI3730测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位点。3.MassArraySNP分型方法技术原理：SequenomMassArray系统主要是利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行分析，即PCR扩增产物或者预处理样本在延伸单碱基后，将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒

3、(10-9s)强激光激发，由于基质分子经辐射吸收能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率得以分离，在真空小管中飞行到达检测器。4.直接测序法技术原理：将待检测片段进行PCR扩增并直接测序是SNP检测方法中最准确的方法。纯合位点为单峰，而杂合峰为套峰，因而很容易将几种基因型区分开来。直接测序法不仅可用于对已知位点的检测，还可用于发现未知的SNP位点5.Taqman探针方法技术原

4、理：在PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，它们可分别与2个等位基因完全配对。正常情况下，由于探针5′端荧光基团和3′端淬灭基团紧邻在一起，荧光被淬灭。随着PCR的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被TaqDNA聚合酶5′→3′外切酶活性切割，致使探针5′端上的荧光基团与3′端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告荧光基团被激活；而与模板不能完全配对的探针（代表另一种等位基因）不能被有效切割，故检测不到荧光信号，通过相应仪器检测荧光值的变化即可实现SNP位点检测。CNV分型_qPCR在PCR扩增过程中，PCR产物的量可以用

5、公式Y=A（1+R）n来表示，其Y表示PCR产物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的扩增效率，n表示PCR的循化数。竞争性PCR涉及到两组模板，一组是待测样本，另一组是人工合成的一段核酸序列，和待测样本目标位点的序列相比只是在长度上（存在一些碱基的插入或缺失）存在一些差异，用作内对照。当两组模板处于同一PCR反应体系中时，两者具有相同的反应环境和引物结合位点而且扩增片段的序列组成基本相同，在此情况下两组模板的扩增效率接近一致，因此两种扩增产物量的比直观的反映了初始模板（待测样本和内对照不存在拷贝数差异）浓度的比，可以根据

6、内对照的初始模板的量来计算样本的浓度。在检测拷贝数变异时，当待测样本和内对照有相同的浓度或削除两种模板浓度差异带来的影响时，PCR产物量的比值直接反映两模板拷贝数的差异。locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomisse

7、dfatal,whennightcame造成测序结果中N值较多原因◆PCR产物直接进行测序，序列结束后无反应信号。PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿色峰），这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的，这样我们很容易辨别PCR产物结束的位点。在此序列以外就不是我们所要的序列了。◆在序列的起始端有时会有一些N值。该种情况主要是有未去除的染料单体、样品小片段、引物二聚体的干扰造成。干扰峰和正常序列峰重叠在一起，仪器无法正确判断出为何碱基。MAP公司染料干扰问题基

8、本解决。MAP公司测序一般20BP以后就可精确读取。◆在序列的3’端容易产生N值。一个测序反应一般可以读出800-1000bp的碱基，如果样品好可以精确读取800bp，占总反应80%左右，但是，有20%只能保证600bp以前的碱基是可靠的，会有许多碱基分不开，就会产生N值，这种情况下产生的