DNA甲基化和去甲基化.docx

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1、DNA甲基化动态：发生、保持和去甲基化一、甲基化DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。中文名甲基化检测外文名detectionofmethylation目录1.1 甲基化检测2.2 检测程序3.3 送样要求甲基化检测编辑DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使

2、CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。检测程序编辑1．甲基化特异性的PCR（Methylation-specificPCR，MSP）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设

3、计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。2．亚硫酸氢盐测序法（BisulfitesequencingPCR，BSP）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，

4、这种方法称为BSP-克隆测序法。3．高分辨率熔解曲线法（HighResolutionMelting，HRM）在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。在动物中，DNA甲基化主要发生在CG二核苷酸背景下，由从头甲基化转移酶(denovomethyltransferases)中的DNA甲基化转移酶3(Dnmt3)家族催化发

5、生，由保持甲基化转移酶Dnmt1催化保持。而在植物中，DNA甲基化可以发生在各种背景下的C碱基上，包括CG、CHG(H=A、T或C)以及CHH，以CG为主。CG甲基化主要发生在genebody区，而CHG和CHH甲基化主要发生在转座子区域以及重复序列区，从头甲基化均由Dnmt3的同源酶DRM2催化发生，但是保持却因背景不同而各异。CG由Dnmt1的同源酶MET1催化保持，CHG由CMT3催化保持，而CHH依旧由从头甲基化酶DRM2催化保持。在植物中，RNA介导的甲基化(RNA-directedDNAmethylatio,RdDM))能够识别各种背景下

6、的胞嘧啶，使其发生甲基化从而调控基因的表达。与转座子和重复元件相关的单链RNA(ssRNA)被认为可能是由聚合酶IV(PolIV)转录生成，之后在RDR2(RNA-dependentRNApolymerase)作用下生成双链RNA(dsRNA)，再由DCL3(一种类Dicer蛋白)切割形成24nt的siRNA，之后蛋白质AGO4(argonaute)与RNA-RNA或RNA-DNA交互作用,可能导致依赖RNA的DNA甲基化酶DRM2催化C的从头甲基化,并通过CMT3、MET1和DRM2维持其甲基化。对拟南芥的研究发现，在种子发育过程中，胚乳中往往会发

7、生广泛的去甲基化，而胚却发生高甲基化。在雄配子形成时营养核(vegetativenucleus)中转座子和重复元件被重新激活，产生大量相关的siRNA，通过未知途径进入精子细胞中，通过RdDM通路加强精子中转座子和重复元件的沉默。在雌配子形成时中心细胞中发生广泛的去甲基化，转座子和重复元件被激活，大量相关的siRNA由此产生，这些siRNA通过未知途径进入卵子细胞中加强其中转座子和重复元件的沉默。而在双受精过程中一个精子与二倍体中心细胞结合发育成胚乳，可见胚乳中观察到的低甲基化来源于中心细胞的去甲基化。而另一个精子与卵细胞结合发育形成胚。动物DNA甲

8、基化主要发生在胚胎发育早期，大约在着床期就已经形成。与植物不同，在动物中是由piRNA和PIWI蛋白(在动物