质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序

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1、质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1.从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。2.取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。3.将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4.4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。将离心管倒扣在吸水纸上，

2、尽量倒尽管中的培养基。5.每管加入预冷的0.1mol/lCaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。转移到一个离心管中，共8ml。6.冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。7.沉淀用预冷的1.6ml含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。二、溶液的配置1.LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeastextract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调P

3、H至7.0，在补足水至1L。高压灭菌20分钟备用。2.0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1gCaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。3.配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4.配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。取出后，稍冷却，一个60mm的培养皿中加入约20ml培养基，无菌条件下铺板。5.选择性培养基：培养基+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌2

4、0min，取出后放于60OC水浴，保持60oc温度加入100mg/ml的氨苄青霉素（Amp）即100mlLB加入100μlAmp(Amp终浓度达到50μg/ml），摇匀后铺板（20ml/板）上盖稍打开，37度烘箱/室温下放置干燥1-2天，封口膜包裹后贮4℃保存备用。三、质粒转化注意：取两管感受态细胞①：为空白对照，不加质粒②：加入质粒；每管加入量：体积<10μl，DNA<50ng；质粒稀释成0.02μg/μl；200μl感受态细胞中加入2μl浓度为0.02μg/μl质粒。具体步骤：1.取两管感受态细胞冰上放置解冻，同时质粒冰上解冻，开启水浴锅42℃管①空白对照，不加质粒；管②加

5、入2μl0.02μg/μl的质粒，混匀，冰上放置30min2.42℃水浴90s，不摇3.取出，置冰上2min，加入LB300μl，37℃，200r/min振荡培养1小时，复苏细胞。同时将选择性培养基置于室温1小时。4.取上述转化菌液150μl涂布在相应的培养板上：⑴不含Amp的培养板——不含质粒菌液⑵含Amp的培养板—a：不加质粒菌液；b：加质粒菌液正面培养1h后，倒置培养过夜。5.观察菌落生长情况，取含Amp培养板上加入含质粒菌液后生长的菌落，加入到5mlLB液体培养基中（加入Amp5ul），37℃培养12h。6.用含甘油30%的LB保存，-70℃备用（甘油消毒、高压灭菌）。

6、三、质粒提取1.已转化好质粒的细菌加入到含有抗生素的LB培养液总共大概150ml在37℃恒温箱中摇菌过夜。2.将细菌分装在4个50ml的离心管中，7000r/min，10分钟离心，倒掉上清。同时取10mlP1溶液加入10μl的酶抑制剂，备用。3.在每个离心管中加入1mlP1：酶抑制剂（1：1），吹打悬浮沉淀，然后将所有菌液集合到同一个离心管中。4.加入5ml的P2溶液，轻柔的颠倒20次。放置4分钟。一旦加入P2，应立刻盖上盖子，以防酸化。GenomicDNA裂解物是粘性物，切勿将溶解时间超过5分钟。5.加入5ml的P3溶液，轻柔的颠倒20次。冰上孵育20分钟。加入P3后，会产生

7、蓬松的白色物质，沉淀物变得不粘，沉淀物包括genomicDNA,Protein,细胞碎屑和SDS6.13000r/min,30分钟离心，将上清倒至盖有一层纱布的吸附柱（Qiagen-tip100）中，吸附柱下放置一个装废液的饭盒。吸附柱使用前应用约4ml的QBT平衡，上清液应快速加入柱中，如果上清放置时间长则会变得混浊，系蛋白沉淀所致，须再次离心。7.待滴完之后，加满QC液洗去残液，滴完后再重复一次。8.用5mlQF液洗脱柱上的质粒至10ml离心管中。9.加入3.5ml异丙醇，颠倒混匀，13