[学术报道]微生物法在维生素分析中的应用

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1、中国疾病预防与控制中心营养与食品安全所石磊 　　微生物法最根本的原理在于利用了微生物对于某些营养物质的特异性。大量的研究发现，某种微生物会对某种维生素具有极强的特异性，是其正常生长所必需的维生素，并且在一定条件下，其生长与繁殖速度与溶液中该维生素的含量成一定的对应关系，含量高则生长快，反之则慢，微生物法便利用了这种对应关系间接地测定出样品中该维生素的含量。　　一般来说，可以采用比色、比浊、滴定的方法进行测定。　　微生物分析法的发展和微生物学、生物化学、营养学以及食品科学的发展密不可分。1889年，Beijerinck首次发现酵母菌的生长与其生长环境

2、中的某些营养成分存在一定对应关系，Williams于1897年首次提出利用微生物测定维生素的构想，从此，微生物分析方法便逐渐的发展起来。20世纪20年代到40年代，是微生物分析方法迅猛发展的时期。在此期间，1939年，Snell和Strong采用乳酸杆菌成功的测定了食物中的核黄素，Kuiken和他的同事Wood于1943年建立氨基酸的微生物分析法。50年代后，微生物分析方法进入了鼎盛时期，许多维生素的微生物测定方法相继建立，并广泛地应用于食物、药剂以及饲料等各类样品的分析测定，如维生素B6、维生素B12、尼克酸、泛酸、生物素、胆碱、叶酸、肌醇等，这

3、种状况一直持续到80年代后期。　　一、微生物分析方法的应用现状　　进入90年代以来，随着分析技术的不断发展，分析方法逐渐朝着高效、快捷、简便的方向发展，由于微生物法固有的许多弊端，因此微生物方法已有被仪器分析方法所取代的趋势。以英国食物成分数据库为例，在1974年版的食物成分数据库中，维生素B1、维生素B2、尼克酸和维生素B6的分析方法为微生物法，而在1984-1989年期间，这些维生素的分析方法均被替换为HPLC法或。　　1．微生物仍旧是维生素分析的重要手段 　　由于微生物分析方法的经典性，准确可靠性以及广泛适用性，所以许多国际标准方法机构仍旧将

4、微生物法作为部分维生素分析的标准方法或第一方法。在最新的第17版AOAC（AssociationofOfficialAnalyticalChemists）分析方法中，食物中生物素、泛酸、叶酸、维生素B6、维生素B12、尼克酸的第一分析方法均为微生物法，维生素B1和B2的第二分析法为微生物法。在AACC(AmericanAssociationofCerealChemists)审批方法中，叶酸、维生素B6、维生素B12、尼克酸的标准分析方法均为微生物法。 　　目前，即使在许多发达国家的食物成分数据库中，微生物法仍旧是维生素分析的一个重要手段。表1列出了

5、美国、英国、新西兰以及我国的食物成分数据库中采用微生物法分析维生素的情况。表1微生物法在不同国家食物成分数据库中的应用情况  维生素种类比例 美国  叶酸、生物素、泛酸、维生素B12 20%（20种维生素） 英国 叶酸、生物素、泛酸、维生素B12 30.8%（13种维生素） 新西兰 叶酸、维生素B12 29%（7种维生素） 中国 叶酸、生物素、泛酸、维生素B12、维生素B6、尼克酸 42.8%（共14种维生素）　　从表1中可看出，对于异构体较多或食物中含量较低的维生素，大部分国家采用微生物法，而对于一些形式单一或自然界含量较高的维生素均采用了化学法

6、或仪器分析法，比如维生素B1、B2、尼克酸等。　　2．不同类样品中维生素分析方法的多元化 　　随着分析理论和技术的快速发展，分析方法也逐渐走向多元化。生物样品、药剂、婴儿配方食品中的部分维生素分析由原来的微生物法逐渐转变为HPLC法或其它分析法。　　表2不同样品中同一维生素的常用分析方法　　生物样品药剂婴幼儿配方食品天然食物 　　生物素HPLC,HPLCHPLC微生物法 　　泛酸微生物法 　　叶酸微生物法 　　维生素B12微生物法 　　尼克酸微生物法　　由于食物样品的组成成分远比其他类样品复杂，并且大部分维生素以结合态存在于其中，在使用仪器法测定时

7、，通常会由于干扰物多而降低了方法的灵敏度。表2的数据提示，目前使用微生物法最多的样品仍旧是天然食物样品，而其它形式样品中维生素的分析方法均已被HPLC法或其它方法所替代。　　二、当前应用微生物法的优势及存在问题　　1．微生物法的优势 　　微生物法沿用至今已有近50年的历史，这也归功于其无法替代的优势，主要有以下几方面：　　l具有极高的灵敏度; 　　由于微生物最根本的是利用了微生物对于营养素的敏感性来测定，而生物体的敏感性是其他任何仪器都无法替代的，所以微生物法的灵敏度比其他仪器法、化学法都要高。 　　从表3可发现，采用ATCC7830测定维生素B1

8、2时，该方法的灵敏度仅为0.001ng/ml，这也是当前大部分国家采用微生物法测定食物中维生素B12的原因所在，因为食物中