荧光实时定量pcr检测老年人外周血淋巴细胞β和β肾上腺素能受体基因mrna表达_论文

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1、荧光实时定量PCR检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体基因mRNA表达【摘要】目的建立荧光实时定量PCR法检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体(AR)基因mRNA表达。方法随机选择ASAⅠ～Ⅱ级老年患者30例，分离外周静脉血淋巴细胞，采用荧光实时定量PCR法检测β1和β2AR基因mRNA表达，并与半定量PCR检测结果进行比较。结果30例患者外周血淋巴细胞荧光实时定量PCR均检出β1和β2ARmRNA表达，不同性别组同一基因表达量无显著差异（P>）；荧光实时定量PCR检测β2ARmRNA表达量显著高于β1AR

2、mRNA(P【关键词】荧光实时定量PCRβ肾上腺素能受体mRNA淋巴细胞老年人　Abstract：ObjectiveToestablisharealtimequantatitivepolymerasechainreaction(PCR)methodforthedetectionofβ1andβ2ARmRNAexpressioninelderlypatients’peripherallymphocytes.MethodsThirtyelderlypatientswithASAgradeⅠ-Ⅱwererecruited.Theirblo

3、odwascollectedandthelymphocteswereisolated.Theexpressionsofβ1andβ2ARmRNAweredetected10/10withfluorescentquantitativerealtimePCRandsemiquantitivewereexpressionsofβ1andβ2ARmRNAinallthesubjectswithrealtimePCR,andthelatterwassignificallymoreabundantthantheformer(P).Wit

4、hsemiquantivePCR,theratioofβ2ARmRNA/β1ARmRNAdecreasedwhenthecyclesincreased(PKeywords：realtimepolymerasechainreaction(PCR);βadrenergicreceptor;lymphocyte;elderlypatient人外周血淋巴细胞与心肌细胞表面βAR密度成显著正相关［1］。以淋巴细胞为模型，间接反应各种病理生理状态下心肌细胞βAR表达变化，被多数研究所证实。然而，淋巴细胞βAR亚型分布存在较大争议：早期

5、研究认为，淋巴细胞仅表达β2AR［2］。最新研究发现，人外周血淋巴细胞存在β1、β2和β3AR三种亚型，且β1和β2ARmRNA丰度相近［3］。既往检测淋巴细胞βAR基因表达多采用半定量PCR，该方法属终点检测法，比较目的基因起始拷贝量准确度较低。本研究采用荧光实时定量PCR，检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2AR基因mRNA表达，并与半定量PCR结果比较。　　1材料与方法试验对象10/10随机选择拟全麻下行择期手术的老年患者30例，其中男、女各15例，年龄65~80岁（平均岁），ASAⅠ~Ⅱ级，既往无心血管系统及血液系统疾病。

6、主要试剂及仪器人淋巴细胞分离液（美国Sigma公司）、TrizolTMRNAIsolationReagent(美国Invitrogen公司)，、ReverseTranscriptionSystem(美国Promega公司)，SYBRGreen(日本Takara公司)。BIORADiCycleriQMuhicolorRealtimePCRDetectionSystem(美国BioRad公司)；GeneAmpPCRSystem2400(美国ABI公司)；高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)；DNA电泳仪(Hoefer公司)；Fluo

7、rS凝胶成像仪(美国BioRad公司)；紫外分光光度计UV240(日本)。引物设计与合成根据NCBIGenbank中人类β1AR、β2AR和βactinmRNA全长序列（登录号：NM000684、NM000024和NM001101）采用Primer3软件(http：///cgibin/primer3/primer3www．cgi)进行引物设计(表1)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物合成后用超纯水溶解，每条引物浓度均为20μmol，等比例混合后-20℃保存备用。表1β1AR、β2AR、actincDNA的引物序列

8、（略）10/10总RNA提取与cDNA合成外周血淋巴细胞分离术晨8：00~9：00抽取所选病例静脉肝素抗凝血5ml，Boyum法分离淋巴细胞（参照人淋巴细胞分离液使用说明）。1×PBS液调整细