豇豆根腐病病原分离鉴定及其核糖体rdna-its序列分析

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1、豇豆根腐病病原分离鉴定及其核糖体rDNA-ITS序列分析摘要：采用形态学及分子生物学的方法对采集自武汉的豇豆根腐病分离物进行形态学和分子生物学鉴定。结果表明，菌株ｊｇｆ形态学上为茄腐皮镰孢菌；对ｊｇｆ菌株的核糖体ｒｎａ基因内转录间隔区（ｒｄｎａ－ｉｔｓ）进行了ｐｃｒ扩增和序列测定，并在ｇｅｎｂａｎｋ中进行了ｂｌａｓｔ搜索和比对分析，根据ｒｄｎａ－ｉｔｓ序列分析结果结合豇豆病株症状和病菌的形态学特征，认为武汉地区豇豆根腐病的病原菌为茄腐皮镰孢菌（ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｓｃｈｌ．）关键词：豇豆根腐病；形态学；分子鉴定；ｒｄｎａ－ｉｔｓ分析；ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｓｃｈｌ．

2、pathogenyisolationandidentificationofcowpearootrotdiseaseandsequencingofribosomalrdna-itsｗｕｒｅｎ－ｆｅｎｇ１，ｙａｎｇｓｈａｏ－ｌｉ１，ｗａｎｐｅｎｇ２，ｈｕａｎｇｗｅｉ２（１．ｗｕｈａｎｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆvｅｇｅｔａｂｌｅsｃｉｅｎｃｅｓ，ｗｕｈａｎ４３００６５，ｃｈｉｎａ２．ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆｐｌａｎｔｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｓｏｉｌｓｃｉｅｎｃｅ，ｈｕｂｅｉａｃａｄｅｍｙｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｗｕｈａｎ４３００６４，ｃｈｉｎａ）ａｂｓｔｒａｃｔ：ｔｈ

3、ｅｆｕｎｇａｌｉｓｏｌａｔｅｊｇｆｆｒｏｍｃｏｗｐｅａｒｏｏｔrotdisease，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｗｕｈａｎ，ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ．ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｊｇｆｗｅｒｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｓｃｈｌ．ｔｈｅｒｄｎａ－ｉｔｓｇｅｎｅｓｏｆｉｓｏｌａｔｅｊｇｆｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｂｌａｓｔｓｅａｒｃｈａｎｄｔｈｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｉｎｇｅｎｂａｎｋｄａｔａｂａ

4、ｓｅｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｓ，ｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｏｆｃｏｗｐｅａｒｏｏｔrotdiseaseｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｓｃｈｌ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｏｗｐｅａｒｏｏｔrotdisease；ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｒｄｎａ－ｉｔｓｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ；ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｓｃｈｌ豇豆是我国主要蔬菜作物之一，其多季节、多模式、多花色和短周期栽培成为农民增收的主导性蔬菜。湖北常年种植面积４万ｈｍ２，武汉市豇豆种植面积约０．６７万ｈｍ２，作为

5、“豇豆之乡”的武汉市新洲区双柳街，年种植约０．４万ｈｍ２次。但是生产中，常因栽培管理不当或环境条件的影响，造成病害的流行，特别是土传病害。豇豆根腐病（ｃｏｗｐｅａｒｏｏｔ）［１］是豇豆的一种典型的土传病害，随豇豆种植年数的增加、面积的扩大、品种的变化等，已成为豇豆上发病最重、危害最大、防治最困难的病害。本研究从武汉地区豇豆种植区采集并分离发病豇豆根腐病病菌，并进行鉴定，为后续的研究提供基础材料和条件。１材料与方法１．１标本来源与病原菌的分离纯化标样于２００９年采自武汉市蔬菜科学研究所试验基地。病原真菌的分离方法参照方中达［２］的植病研究方法有关介绍，选取新发病豇豆植株茎基部的根颈

6、作为分离材料，进行常规组织分离，经单孢纯化、培养获得单孢菌株。１．２致病性测定采用ｋｏｃｈｐｓ法将发病组织上分离到的病原菌纯培养物（孢子）制成悬浮液（１０５～１０６个孢子／ｍｌ）。采用自然伤根浸孢子液接种植株。取生长良好的无病豇豆苗，用无菌水将根颈部表面冲洗干净，然后使根完全浸在孢子悬浮液中３０ｍｉｎ，接种后植株定植于装有灭菌沙土的花盆中。每个菌株接种８株苗，３次重复，以无菌水为对照。植株置于２５℃下光照培养箱中，接种后每隔１～２ｄ观察１次。发病后，从病斑处再次分离病原菌，确认致病菌。１．３病原菌形态学鉴定１．３．１ｐｄａ上的病菌形态特征观察将供试菌株接种到ｐｄａ培养基上，２５℃

7、恒温培养。７ｄ后观察培养基上的菌落形态，制作玻片，光学显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗的形态特征，并测量分生孢子的大小。１．３．２产孢表型观察产孢表型的观察采用滤纸片法。参照张天宇［３］的方法，取滤纸剪成比载玻片稍小的长方形，将中心挖一边长约１０ｍｍ的方孔，灭菌后用无菌水润湿放于无菌载玻片上。挑取少量活化的菌丝块均匀涂于滤纸中央方孔的边缘，然后将载玻片置于铺有湿润滤纸的灭菌培养皿中，２５℃恒温培养。４８ｈ后显微镜下观察产孢表型。１．３．３形态学鉴定依据根据菌落形态、生长速度和色素