蛋白质结构与功能 翻译

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1、由细胞周期调节的羧基末端磷酸化介导的Akt激酶的活化Akt（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）,也称为蛋白激酶b，在细胞生存、增殖、新陈代谢中发挥着重要作用。Akt超活化能导致包括人类癌症在内的许多病理学状况，并与不良预后，化疗和放射疗法有着密切联系。S473和T308位点的磷酸化会激活Akt，然而，是否有更多机理参与调节Akt整个活化以及Akt超活化和细胞周期失控这一癌症特征是否关联至今还不清楚，这里，我们发现Akt活动随着细胞周期波动，反映细胞周期蛋白A表达。位于AktC末端的S477和T479位点通过细

2、胞周期依赖的激酶2或周期蛋白A或mTORC2磷酸化，在不同生理条件下，促进或功能性补偿位于AktS473的磷酸化。另外，删除鼠嗅球中的细胞周期蛋白A2等位基因导致S477和T479位点的磷酸化程度降低，细胞凋亡水平上升。显著地，细胞周期蛋白A2等位基因的删除诱导鼠胚胎干细胞凋亡的情况被Akt1S477D和T479E位点所缓解，支持了cyclinA2调节Akt激活的生理功能。另外，我们研究的结果显示AktS477和T479磷酸化是Akt激活，调节其磷酸化机制的基本环节，这里提供了一个癌细胞异常细胞周期

3、和Akt超活化之间的新联系。利用活体单细胞成像技术，我们发现，Akt的活化波动在整个细胞周期中，反向地与CDT1相关（图1a和补充图1a）。免疫染色统计分析HeLa细胞进一步表明AKT-pS473也有类似的周期性功能是作为联会蛋白（图1b）。值得注意的是，在一些肿瘤细胞系（图1C，D和补充图1b中，c）中，Akt的磷酸化，但不是总Akt蛋白丰度，波动在整个细胞周期。周期性的Akt磷酸镜像周期蛋白A2的表达模式，是哺乳类主要的cyclinA表型，在细胞周期的进程（图1c，d）所示。此外，细胞周期蛋白A

4、2或Cdk2，而不是细胞周期蛋白E的急性枯竭，造成Akt磷酸化水平的下降，没有对Akt上游激酶PDK1和mTORC2的磷酸化水平有显著影响（图1d）。这促使我们评估Cdk2/cyclinA是否在细胞周期过程中依赖磷酸化直接调节Akt的活化。支持Akt作为一个CDK2/cyclinA的底物，Akt的亚型与细胞周期蛋白A2互相联系（图2a和补充图2a）。此外，我们在Akt1酶上确定了四个“RXL”周期蛋白A-相关结构域（图2b），所有这些都是进化上保守的（补充图2b）。R76CL或R273DL在较小程度

5、上的突变，R200VL或R370TL（RXL到的AXA）的衰减与细胞周期蛋白A2（图2c）Akt1相互作用，并降低了Akt1的活动（补充图2c）。始终，消耗周期蛋白A2或Cdk2（补充图2D-F），导致了Akt磷酸化程度的显著减少。更重要的是，无论是与CDK2的急性治疗抑制剂（图2d）或缺失细胞周期蛋白A2ff__细胞周期蛋白A2主要的等位基因的小鼠胚胎成纤维细胞，（MEFs）（图2e）导致了Akt磷酸化水平的显著降低，并没有显著影响细胞周期进程（图2d和文献14），不包括间接的可能通过抑制Cdk2

6、/cyclinA。值得注意的是，缺失cyclinA2导致Akt磷酸化水平显著下降，而不是由cyclinA1或者细胞周期蛋白E1/E2等位基因而引起（图2f，g），而相反地，细胞周期蛋白A2的异位表达（图2H和补充图3A）导致Akt磷酸化水平的上升和体外锚定非依赖性生长的增强（补充图3b，三）。而且，消耗控制细胞周期蛋白A转换的E3连接酶Cdh1，导致细胞周期蛋白A2的丰度增加和的Akt的磷酸化水平提高，导致体外锚定非依赖性生长的增强（附图。三维，e）和体内肿瘤的形成（图2i和补充图。3F-H）。更重

7、要的是，通过消耗Cdh1增加Akt磷酸化和致瘤性可以通过额外消耗细胞周期蛋白A2部分地逆转（图2J和补充图3I-1）。总的来说，这些结果支持Cdk2/cyclinA2作为调控Akt磷酸化和致癌作用的主要生理激酶。值得注意的是，CDK2/细胞周期蛋白A在体外直接磷酸化Akt1酶的羧基（C）-末端区域（补充图4a，b）。连续截断实验显示出Cdk2/细胞周期蛋白的磷酸化位点是定位在最后四个进化上保守的残基和随后的精确定位诱变显示S477和T479作为Cdk2/细胞周期蛋白A的位点（附图。4C-E）。同样，

8、CDK2/细胞周期蛋白磷酸化的Akt2-S478（补充图。4F）。有趣的是，G478突变为脯氨酸（G478P）以模拟典型的Cdk2'的SP/TP'磷酸化结构域16,17，或以其它笨重的氨基酸（L/W/R），并没有显著影响Cdk2/细胞周期蛋白A诱导的Akt的磷酸化（补充图4G）。相反的，C端增加一个α螺旋18（补充图4G）或绿色荧光蛋白（GFP）（补充图4小时）会降低CDK2/细胞周期-A介导非尾端S477G478-的磷酸化，而不是S477P478-Akt1酶。这些数