绿色植物中色素的提取和分离

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1、绿色植物中色素的提取和分离[实验名称]绿色植物色素的提取及色谱分离[教学目标]知识与技能:通过对绿色植物色素的提取与分离，了解天然产物分离提纯的方法[教学重点]学习柱色谱和薄层色谱分离的基本原理及操作方法[教学难点]薄层色谱、柱层析实验操作要点的掌握和应用[教学方法]陈述法，讲演法[教学过程][讲述]【实验目的】1.通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；2.通过对柱色谱和薄层色谱操作方法的掌握，加深了解微量有机物色谱分离、鉴定的原理。[讲述]【背景知识】绿色植物的叶、茎中，如菠菜叶

2、，含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被甲酰基所取代从而形成了叶绿素b。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-胡萝卜

3、素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素，其中β-胡萝卜素含量最多，也最重要。叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。本实验先根据各种植物色素的溶解度情况将胡萝卜素（橙）、叶黄素（黄）、叶绿素a和叶绿素b从菠菜叶中提取出来，然后根据各化合物物理性质的不同用色谱法进行分离和鉴定。[图示]【分离产物结构式】叶绿素a、叶绿素b、叶黄素（黄）和β-胡萝卜素的结构式如下图所示：[讲述]【色谱法原理】色谱法是分离、提纯

4、和鉴定有机化合物的重要方法。其分离原理是利用混合物中各个成分的物理化学性质的差别，当选择某一个条件使各个成分流过支持剂或吸附剂时，各成分可由于其物理性质的不同而得到分离。与经典的分离提纯手段（重结晶，升华，萃取和蒸馏等）相比，色谱法具有微量、快速、简便和高效等优点。按其操作不同，色谱可分为薄层色谱、柱色谱、纸色谱、气相色谱和高压液相色谱等。在此，我们学习柱色谱和薄层色谱（TLC）。1.柱色谱原理液体样品从柱顶加入，流经吸附柱时，即被吸附在柱中固定相（吸附剂）的上端，然后从柱顶加入流动相（洗脱剂）淋洗

5、，由于固定相对各组分吸附能力不同，以不同速度沿柱下移，吸附能力弱的组分随洗脱剂首先流出，吸附能力强的组分后流出，分段接收，以此达到分离、提纯的目的。2.薄层色谱原理由于混合物中的各个组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时，发生无数次吸附和解吸过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于各组分具有不同的移动速率，最终得以在固定相薄层上分离。其应用主要有：跟踪反应进程；鉴定少量有机混合物的组成；分离；寻找柱色谱的最佳分离条件等。[提问]试比较叶绿素

6、、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快？[讲述]【实验试剂】新鲜菠菜3g、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、硅胶G、中性氧化铝[讲述和演示]【实验步骤】1.菠菜色素的提取过程取3g新鲜菠菜叶于研钵中拌匀研磨5分钟，残渣用20mL的石油醚-乙醇（2:1）混合液进行提取，共提取两次。把浸取液合并过滤，滤液转移到分液漏斗中，加入等体积的水洗涤后弃去下层的水-乙醇层，石油醚层再用等体积的水洗涤两次，以除去乙醇和其它水溶性物质。石油醚层用无水Na2SO4进行干燥、浓缩为2mL。取一半做

7、柱层析分离，其余留作薄层层析分析。2.柱色谱的一般过程及菠菜色素的分离：【柱色谱的一般过程】（1）选择吸附剂：常用的吸附剂：氧化铝，硅胶，氧化镁，碳酸钙，活性炭等选择规则：吸附剂必须与被吸附物质和展开剂无化学作用；吸附剂的颗粒大小要适中；可以根据被提纯物质的酸、碱性选择合适的吸附剂。化合物的吸附能力与分子极性的关系：分子极性越强（或分子中所含极性较大的基团）其吸附能力也较强。极性基团的吸附能力排序如下：（2）选洗脱剂：根据被分离物各组分的极性和溶解度选择相应极性的溶剂，当单一溶剂无法很好洗脱时，可考

8、虑选择混合溶剂。溶剂的洗脱能力按递增次序排列如下：己烷（石油醚）、四氯化碳、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、丙醇、乙醇、甲醇、水。（3）装柱：色谱柱的大小应视处理量而定，柱长与直径之比，一般为10:1~20:1。固定相用量与分离物质用量比约为50:1~100:1。装柱的方法分湿法和干法两种，无论哪一种，装柱的过程中都要严格排除空气，吸附剂不能有裂缝。上样前必须使吸附剂在洗脱剂的流动过程中进行沉降至高度不变为止，此为压柱。（4）上样：将要分离的混合物用适