荧光检测毛细管电泳法

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1、通过荧光检测毛细管电泳法快速灵敏地检测人体血浆中的亚硝酸盐的方法本文选自塔兰塔(Talanta)，爱思唯尔(Elsevier)出版，纯分析化学期刊。作者：安范舒普代尔，来自比利时鲁汶大学。摘要:分析亚硝酸盐,NO指示剂在体内的产生,为研究NO在体内的合成提供了一个有用的工具。通过其衍生反应和2、3二氨基萘(DAN)中一个快速、灵敏荧光-毛细管电泳法被发展来测定了人体血浆中的亚硝酸盐。亚硝酸盐在人体血浆中很容易与DAN在酸性条件下反应得到收益率很高的荧光2,3-萘酚三唑(NAT)。荧光检测是完成施达赛检测的最佳化方式，它允许一种等

2、离子体样品的直接分析而不像大多数堆积样品的CE-UV方法。乙腈可去除蛋白质。短程注射和高压电(30千伏)可缩短分析时间。用20mm,pH值为9.23的缓冲溶液可更好的分离。NAT的分离在1.4分钟内完成，除蛋白等离子体样品以5s每50mbar水动力地的速度被注射到60厘米×75微米的内部直径无涂层的玻璃毛细管里。激发波长被选中为一个宽带滤波器(240-400nm),发射光在418nm被测量通过采用一个截止过滤器。在2到500nm的范围内获得一个好的线性关系(R2=0.9975)。在原始血浆样本中亚硝酸盐的检测极限是0.6nm,比

3、我们此前的CE-UV法低了750倍。先进的荧光-毛细管电泳法相对于目前的荧光高效液相色谱法，具有更简单的系统和更低的成本优势，同时也很灵敏。这个研究表明该方法测定人体血浆中亚硝酸盐在的浓度与频繁报道的一致。1介绍研究表明，亚硝酸盐在生理和病理条件下有可能成为NO合成的一个标志，因此在实验和临床研究中可能作为一个生化参数。但是到目前为止，还没有真正关于人体血浆中亚硝酸盐的浓度的共识。具报告，一般水平的亚硝酸盐在人体血浆中“不能检测”的范围达到26微米。人体血浆中亚硝酸盐的浓度最合理的范围是从100纳米到1微米，通过大多数研究者团体

4、的测量最常报道的结果是从100纳米到200纳米。因此，对于分析学科来说测定人体血浆中的亚硝酸浓度是一个挑战。在样品配制的过程中，高灵敏度测定和一定的防范措施可以提高测量的精密度和准确度。荧光法已广泛用于亚硝酸盐的灵敏分析。这些方法涉及亚硝酸盐衍生化反应——由2,3-二氨基萘(DAN)合成2,3-萘酚三唑(NAT)。有一些使用高效液相荧光检测的方法用在检测水、尿液和细胞培养液中的亚硝酸盐。然而，大多数荧光高效液相色谱法对样品需要一个复杂的制备过程来去除一些小元件并需要一个保护柱。这些额外的合成步骤可能会引入环境中杂质亚硝酸盐。此外

5、，事实上在碱性pH值为8.5～11.5的条件下NAT是稳定的且具有较高的荧光强度，与常态下稳定的反相高效液相色谱柱不兼容。当流动相的pH值大于8时，普通的玻璃柱开始溶解且寿命缩短。因此，在碱性条件下分析亚硝酸盐，需要特殊的色谱柱，如高聚物型色谱柱。即便如此,在每次使用高效液相色谱后仍需要一个严格的清洁过程。由于其简单的样品制备及清洗过程，毛细管电泳在生化分析中独具优势。虽然各种毛细管电泳-紫外法结合毛细管预浓缩已经达到令人满意的灵敏度，直今仍没有荧光毛细管电泳法用于分析亚硝酸盐。此研究的目的是开发一个快速、简单和灵敏的荧光毛细管

6、电泳法来测定人体血浆中亚硝酸盐。2材料和方法2.1药品所用试剂均为分析纯。亚硝酸钠和十水四硼酸二钠购于默克公司（达姆施塔特，德国）。氢氧化钠和乙腈购于费舍尔科技（拉夫堡大学，英国）。二氨基萘和荧光素均购自于西格玛奥瑞奇化工（圣路易斯，密苏里州，美国）。盐酸是购于美国VWR公司（鲁汶，比利时）。所有的溶液均使用经过Milli-Q梯度系统（密理博，莫尔斯海姆，法国）纯净的蒸馏水配制。用0.2微米的再生纤维素过滤器（华特门公司，达瑟尔，德国）过滤缓冲溶液。2.2样品制备从7名健康的男性志愿者（无饮食限制）中收集静脉血液样本，吸入离心管

7、中分离锂-肝素和血浆，样品采集后用离心机分离血浆样品三分钟左右（3478g，10min，4℃）。血浆被分离后立即在-80℃下冷冻直至下次分析时。在室温下解冻后，加入100μL乙腈使100μL血浆样品脱去蛋白质，用微型高速离心机将14100g的混合物离心5分钟（艾本德，汉堡，德国）。然后，加入5μL0.62MHCl将100μL上层清液的pH值调节到6并伴有衍生反应。全部100μL样品由50μL反应混合液和50μL0.1μM荧光素溶液组成且把它作为内标物，并直接用于注射。这项研究已经通过当地的伦理委员会（鲁汶大学）的批准，项目得到批

8、准。2.3含二氨基萘(DAN)的亚硝酸盐合成萘酚三唑(NAT)含DAN的亚硝酸盐的反应依据Misko等人的方法。在酸性条件下DAN与亚硝酸盐反应迅速，生成强荧光性的产物萘酚三唑（NAT），其在碱性溶液中是稳定的。DAN的原液，将DNA溶于0.62M浓度为2mg/