降解多菌灵木霉tr原生质体制备及再生条件研究[权威资料]

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1、降解多菌灵木霉Tr1原生质体制备及再生条件研究　　摘要：研究可降解多菌灵的木霉菌株Tr1的原生质体制备及再生的适宜条件，发现该菌原生质体制备的最佳条件为菌龄20h，裂解酶液为5mg/mL的溶菌酶和蜗牛酶的混合酶液，二者使用前按照体积比2∶1混合，酶解温度30℃，50r/min缓慢振荡酶解2.5h，渗透压稳定剂为0.7mol/LKCl，原生质体产量达6.44×106个/mL。原生质体再生的优化条件为：PDA为培养基，添加0.3mol/LKCl和0.3mol/L环己六醇作为渗透压稳定剂，采用双层固体培养方式，有助于原生质体的再生。　　关键词：多菌灵；木霉；原生质

2、体；制备；再生　　Q939.96A0439-8114（2016）10-2500-04　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.014　　Abstract：ThesuitablepreparationandregenerationconditionsofprotoplastpreparationofTrichodermasp.Tr1wasstudied.TheresultsshowedtheoptimumconditionforpreparationofprotoplastofstrainTr1：Thecultur

3、etimeofmyceliumwas20h，theprotoplastlysatewasamixedsolutionof5mg/mLlysozymeand5mg/mLsnailenzymeandtheywouldbemixedaccordingtothevolumeratioof2∶1beforeusing，itwasmildlyshakedwithaspeedof50r/minunder30℃for2.5h，0.7mol/LKClwasusedasosmoticstabilizer.Underthiscondition，theyieldofprotopla

4、stcouldbe6.44×106/mL.TheoptimumconditionforregenerationofprotoplastwasPDAasthebasicculturemedium，0.3mol/LKCland0.3mol/Linositolastheosmoticstabilizer，anddouble-layersolidculturewashelpfulforprotoplastregenerationofTrichodermasp.Tr1.　　Keywords：carbendazim；Trichdermasp.；protoplast；pr

5、eparaton；regeneration　　多菌灵（Carbendazim，MBC）是一种高效广谱的苯并咪唑类杀菌剂，其广泛使用给生态环境和人体健康造成了危害[1]。为解决多菌灵农残污染问题，人们开始研究多菌灵降解菌株，目前报道的降解菌株多为细菌，如红平红球菌、假单胞菌等[2，3]。虽然部分菌株对多菌灵的降解效率较高，但由于菌株本身对植物病原菌没有拮抗作用，功能单一且制剂保存期短，市场应用前景受到限制。　　木霉菌是一类重要的植物病生防菌，研究和应用广泛[4]。但多数木霉菌株对多菌灵敏感，因此多菌灵在土壤中的残留影响了木霉的生防效果。筛选和选育降解多菌灵的生

6、防木霉菌，将实现生防和降解农残功能的有机结合。2008年田连生等[5]首次报道一株木霉对多菌灵有一定的降解能力。前期试验筛选到一株可降解多菌灵的生防木霉，但降解效率低。应用原生质体融合技术是目前得到优良菌种的有效方法之一，原生质体没有细胞壁，对诱变剂反应灵敏，容易得到正突变株[6，7]。因此利用原生质体融合技术对哈茨木霉（Trichodermaharzianum）和其他对多菌灵敏感的木霉生防菌株进行种间杂交，有望选育出对多菌灵高效降解的生防木霉菌株。本研究对可降解多菌灵的哈茨木霉Tr1原生质体的制备条件进行了研究，为新菌种的选育奠定了基础。　　1材料与方法　

7、　1.1供试菌株　　哈茨木霉Tr1为山东省应用微生物重点实验室分离获得，对多菌灵具有一定的降解作用，同时对部分植物病原真菌具有一定的抑菌效果。　　1.2培养基　　PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，蒸馏水定容至1000mL。　　无机盐培养基：NH4NO31.0g，NaCl1.0g，K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，MgSO4・7H2O0.2g，琼脂10g，蒸馏水1000mL，多菌灵（100mg/mL）10mL。　　液体培养基：葡萄糖1g，蛋白胨0.4g，酵母膏0.4g，KH2PO40.2g，K2HPO40.4g，MgSO4・7H

8、2O0.005g，pH6.2～6.4。　　STC培养