免疫性肝纤维化大鼠igf-的表达变化及罗格列酮对其的影响

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1、ＩＩＪ西医科大学颈士学位论文材料与方法１材料１．１实验动物：３６只健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠１．２主要设备：没备名称手术器械、器皿等低速台式离心机电冰箱（一２０℃）ＰＨ酸度计恒温烤箱体重（２００±２０）ｇ，购自山西医科大学生理教研室动物室。生产商上海医疗器械有限公司北京医用离心机厂日本三洋公司Ｈ１９３２１ＭｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒＰＨＭｅｔｅｒ上海医疗器械有限公司ＤｅｎｌｅｙＤｒａｇｏｎＷｅｌｌｓｃａｎＭＫ２型酶标仪芬兰ＬａｂｓｙｓｔｅｍＢＪ２０００图像分析系统１．３药物及试剂：试剂名称未灭活猪血清马来酸罗格列酮片水合氯醛福尔马林３％过氧化氢枸橼酸钠大鼠ＩＧＦ

2、—ｌＥＬＩＳＡ试剂盒试剂盒组成：成都泰盟科技有限公司生产厂家兰州民海生物工程有限公司葛兰素史克（天津）有限公司北京化学试剂厂北京化学试剂厂武汉博士德生物工程有限公司北京化学试剂厂上海轩吴科技有限公司酶标板（ＣｏａｔｅｄＷｅｌｌｓ）４８ｗｅｌｌＳＡｎｔｉ—ｒａｔ１６Ｆ—ｌＢｉｏｔｉｎ６ｍｌ浓缩洗涤液（５０Ｘ）（ＷａｓｈｉｎｇＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）显色液（ＴＭＢＳｕｂｓｔｒａｔｅ）终ｌＬ液（ＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎ）７ｍｌ６ｍｌ５ｍｌ标准品（Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）浓缩酶联物（ＨＲＰ）酶联物稀释液（１１ＲＰ１ｓｅｔ６０×７ｍｌＤｉｌＵｅｎｔ）样品稀释液（

3、ＳａｍｐｌｅＤＪｌｕｅｎｔ）５０ｍｌ标准品已经稀释５０咖倍。兔抗大鼠ＩＧＦ—ｌ兔抗大鼠ＴＧＦ一０．武汉博士德生物工程公司武汉博士德生物］Ｉ程公司山西医科大学碰士学位论文ＡＰＥＳ即用型ＳＡｌ３Ｃ免疫组化试剂盒ＤＡＢ显色试剂盒武汉博士德生物工程公司武汉博士德生物工程公司武汉博士德生物工程公司２方法２．１实验分组：３６只（２００±２０）－ｇ健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，在山西医科大学生理教研室动物室由专人饲养，均饲普通饲料，每日三次，自由饮水。随机分为３组：正常对照组（ｎ＝６）、肝纤维化模型组（ｎ＝ｌ８）、罗格列酮干预组（ｎ＝１２，实验过程中有１只在腹腔注射猪血清时死于

4、内出血）。按照于世瀛等报道的方法复制免疫性肝纤维化模型口］。按Ｉｍｌ／１００９体重的剂量，模型组和罗格列酮干预组给予猪血清，正常对照组给予生理盐水，均为２次，周，腹腔注射。罗格列酮组自第５周起按ｌｍｇ／ｋｇ・ｄ的剂量给予罗格列酮片溶于蒸馏水中灌胃，正常对照组和模型组不给药。于第４周末１０％水合氯醛３ｍｌ／ｋｇ麻醉后随机处死模型组一批动物，第６、８周末随机处死模型组和罗格列酮干预组各一批动物，正常对照组同期处理，腹主动脉采血，分离血清（３０００ｒｐｍ，１０分钟），一２０。Ｃ冰箱保存。留取肝组织以１０％中性甲醛溶液固定２４小时。取材，脱水，包埋制作蜡块。４ｕｍ连续切片做Ｈ

5、Ｅ常规染色、ＶＧ染色和ＩＧＦ－１、ＴＧＦ一１３１的免疫组化染色。２．２组织学检查：肝组织４ｕｍ连续切片分别做ＨＥ常规染色及ＶＧ染色，光镜下观察肝脏病理变化及胶原分布情况，肝组织纤维增生程度分级评定标准参考ＲｕｗａｒｙＭ等的文献１４Ｊ，具体为：０级：正常肝组织；Ｉ级：少量胶原纤维自汇管区或中央静脉向外延伸；ＩＩ级：纤维延伸明显，但未包绕整个肝小叶；ＩＩＩ级：纤维互相连接包绕整个肝小叶；ＩＶ级：纤维分割肝小叶成假小叶，但以大方形假小叶为主；Ｖ级：假小叶中大方形和小圆形假小叶各占５０％；ＶＩ级：肝内布满小圆形假小叶，其间布满粗大增生的纤维组织。对ＶＧ染色的切片进行图像分析

6、，采用ＢＪ２０００图像分析系统测定每个视野中胶原着色面积百分比，每例切片测３个视野取平均值。２．３血清ｌＧＦ＿１检测：采用ＥＬＩＳＡ法，试剂盒平衡至室温（２０一２５）℃后，取出所需反应板。１）加入１００ｕｌ标准品、１００ｕｌ已稀释标本于相应反应板孔中。２）轻轻混匀３０秒，２０一２５℃温育２０分钟。３）洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入３５０ｕｌ洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤３次。山西医科大学硕士学位论文４）每孔加入１００ｕｌＢｉｏｔｉｎａｎｔｉｒａｔＩＧＦ．１。轻轻混匀３０秒，２０一２５℃温育２０分钟。５）洗板：甩尽板内液体，

7、用洗涤液沈涤反应板（每７Ｌ内加入３５０ｕｌ洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）：反复沈涤３次。６）每孔加入１００ｕｌ１×ＨＲＰ。轻轻混匀３０秒，２０～２５℃温育１０分钟。７）洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每｝Ｌ内加入３５０ｕｌ洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤３次。８）每孔加入１００ｕｌＴＭＢ显色液，轻轻混匀１０秒，２０一２５℃温育２０分钟。９）每孔加入１００ｕｌ终止液。轻轻混匀３０秒；１５分钟内在ＤｅｎｌｅｙＤｒａｇｏｎＷｅｌｌｓｃａｎＭＫ２型酶标仪上读数。２．４肝脏ＩＧＦ－１、ＴＧＦ－Ｂ．免疫组化染色：采用ＳＡＢ