与耐药机制有关药敏试验的规范化

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1、与耐药机制有关药敏试验的规范化与耐药机制有关的药敏试验的规范化操作。前言，细菌耐药已成为一个全球性的问题，已对人类健康构成严重的威胁。耐药细菌感染导致病人住院时间延长、费用增加、死亡率增高，同时也给临床医生抗感染治疗带来困难。因此，检测细菌耐药机制是当今细菌学的一个重要课题，也是正确指导临床医生合理使用抗生素的重要依据。在细菌耐药机制检测方面，包括分子生物学等许多实验方法被广泛运用。但这些方法的技术要求普遍较高，大多数被用于基础研究。真正应用到临床微生物实验室的试验方法，要求操作简便、重复性好，结果准确、可靠，试验成本不能太高。我国卫生部于1998年规定：我国药敏试验暂按CLSI历年颁布

2、的所有微生物药敏试验文件作为部颁标准，此决定至今未改变。本节所讲内容，主要是CLSI（M100-S22）文件推荐的临床微生物实验室常规检测方法。也是我们从事临床微生物检验技术人员必须掌握的内容。包括两个内容，第一个就是革兰阳性球菌耐药机制的实验室检测项目。第二个内容是革兰氏阴性发酵细菌以及其他细菌的耐药机制。首先介绍青霉素酶的检测。检测青霉素酶的方法有碘量法、酸量法和显色头孢菌素法等，临床应用较多的是显色头孢菌素法。其原理是将受菌株与头孢硝噻吩作用一段时间后，如受试菌株产生青霉素酶，则可水解头孢硝噻吩的β-内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色反应，即为青霉素酶试验阳性。头孢硝噻吩法是目前

3、检测嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和葡萄球菌属产生β-内酰胺酶的最好方法，具有快速、灵敏和简便的特点，但价格相对较昂贵。方法，检测时用1滴无菌水将Nitrocefin纸片湿润，将受试菌直接涂抹于湿润后的Nitrocefin纸片上，即可观察颜色的反应，产生红色者为产酶阳性。质控菌株，阴性株为金黄色葡萄球菌ATCC25923；阳性株为金黄色葡萄球菌ATCC29213。注意事项，目前实验室多采用BD公司生产的非头孢硝噻吩显色头孢菌素纸片，这个纸片进行β-内酰胺酶测试，效果稍好于头孢硝噻吩，可降低金黄色葡萄球菌阳性结果的反应时间。葡萄球菌可诱导β—内酰胺酶的检测。这项内容呢是CLSIM100

4、—S21。方法，如果青霉素对葡萄球菌的MIC值小于等于0.12每毫升微克的时候或者抑菌环直径大于等于29毫米的时候，应该对其进行可诱导β-内酰胺酶的检测。将待检菌株传代到血琼脂平板或者是MHA琼脂平板上，用苯唑西林纸片或者是头孢西丁纸片作为诱导剂，具体方法可参照纸片扩散法药敏试验，大气环境孵育16到18小时后，检测抑菌圈周边细菌的产酶情况。可诱导β-内酰胺酶检测阳性的菌株，应报告对不耐酶青霉素耐药。质控菌株，阴性株用金黄色葡萄球菌ATCC25923；阳性株用金黄色葡萄球菌ATCC29213。CXIM100—S22文件中增加了用10单位青霉素纸片作为诱导剂检测葡萄球菌可诱导β—内酰胺酶的方

5、法，具体方法同苯唑西林和头孢西丁纸片法。第二个内容介绍甲氧西林耐药葡萄球菌，也就是MRS检测。检测mecA基因和其表达的青霉素结合蛋白2a，是预报葡萄球菌对甲氧西林耐药最准确的方法，它也被用于证实从严重感染病人分离的葡萄球菌纸片扩散法药敏试验结果。携带mecA基因或者是产PBP2a的葡萄球菌分离株，应报告对苯唑西林耐药。不携带mecA或不产PBP2a菌株应报告对苯唑西林敏感。由于罕见的非mecA基因介导的苯唑西林耐药机制，在纸片扩散法确定为苯唑西林耐药时，应加测苯唑西林MIC，若MIC值大于等于4个每毫升微克，即使mecA基因和PBP2a检测为阴性，也应报告苯唑西林耐药。可用纸片扩散法检

6、测这些菌株对头孢西丁的敏感性。苯唑西林纸片扩散法筛选试验，方法，使用含1个微克的苯唑西林纸片，而不是甲氧西林或萘夫西林来检测金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药性。用直接菌落悬液法制备接种物，配成0.5麦氏比浊浓度菌液，接种MH琼脂平板，待琼脂表面的水份干后，贴苯唑西林纸片，于33至35度，大气环境孵育24小时，检测抑菌圈直径。结果判断，按CLSI解释标准判断结果。金黄色葡萄球菌抑菌圈直径小于等于10个毫米为耐药，大于13毫米为敏感。质控菌株用金黄色葡萄球菌ATCC25923。注意事项，试验温度超过35度不能检测出MRS；孵育时间不能少于24小时；在透射光下仔细观察苯唑西林纸片周围抑菌圈内有没

7、有细小菌落或者轻微弥漫生长，如果有生长提示苯唑西林耐药；如果金黄色葡萄球菌纸片扩散法结果中，结果为中介时也就是直径在11到12毫米时，或者MIC为0.5到2个每毫升微克的表皮葡萄球菌以外的其他凝固酶阴性葡萄球菌引起严重感染时，必须进行mecA基因或者是PBP2a测定，或者是头孢西丁纸片试验、苯唑西林MIC试验或者是苯唑西林盐琼脂筛选试验，来确定是否为MRS菌株，选择其中一种试验结果进行报告。苯唑西林盐琼脂筛选试验，试验用的MH琼脂中