实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测.doc

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1、实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-

2、1。3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。4.0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048molBaCl2(1.17%W/VBaCl2.2H2O)0.5ml0.18molH2SO4(1%,V/V)99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度

3、。在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。K-B法是由Kirby-Bauer建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。（2）试验菌液准备：将待测细菌接种于普通琼脂平板，35℃培养16~18h，然后从平板上挑取数个菌落，于2~3ml无菌生理盐水中混匀后与0.5麦氏

4、比浊管比浊，调整浊度与标准比浊管相同，其细菌浓度相当于108CFU/ml。（3）细菌接种：用无菌棉拭蘸取已调试的菌液，在管壁上稍加挤压之后，手持棉拭于M-H琼脂表面均匀划线接种，共划3次，每次将平板旋转60°角，最后沿平板内缘涂抹一周，盖上平板，室温下置3~5min待琼脂表面的水分稍干。（4）贴纸片用无菌镊子夹取药物纸片平贴在种好细菌的琼脂表面，每个平板可贴4~6种药物纸片。纸片放置要均匀，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板边缘的距离应不小于15mm。纸片一旦接触琼脂表面，就不能再移动。（5）培养：贴好药物纸片的平板应于室温下放置15min，然后翻转平板，放35℃培养18~2

5、4h之后观察结果。3．结果观察和报告将平板置于黑背景的明亮处，用卡尺从背面精确测量包括纸片直径在内的抑菌环直径，测得结果以毫米为单位进行记录，最后参照NCCLS的标准（见附录）进行结果判断，并以敏感（sensitivity）、中度敏感（morderatesensitivity）和耐药（resistant）等程度报告之。4．注意事项（1）培养基的成分、酸碱度以及平板的厚度等对试验结果都可以造成影响。购买培养基时应考虑其质量，对每批M-H琼脂平板均需用标准菌株检测，合格后方可使用。制备平板时，注意其厚度并且厚薄要均匀。（2）药物纸片的贴放要均匀，并且要充分接触琼脂。药物纸片应始终保存在

6、封闭、冷冻、干燥的环境，否则会影响其活性。长期储存须置-20℃的冰箱，日常使用或没用完的纸片应及时放4℃保存，用时须提前1~2h取出放室温平衡。纸片应在有效期内使用。（3）菌液浓度也可影响试验的结果，浓度大细菌多时抑菌环减小；菌量少时抑菌环则偏大。此外，菌液配好后应在15min内用完。（4）培养温度以35℃为宜。平板的堆放不超过2块，防止受热不均。（5）试验过程严格按要求操作，严格无菌操作。（6）抑菌环的测量要仔细、精确。5．质量控制：以新鲜传代的金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在相同条件下用与常规试验相同的方

7、法测定对同种抗菌药物的敏感性，标准菌株的抑菌环应在预期的范围内。如超出了该范围，则不能向临床发报告，应及时查出原因，予以纠正。标准菌株应每周用M-H琼脂传代，4℃保存。6．临床意义：用于临床细菌常规药敏检测，监测细菌的耐药变迁，指导临床用药。一、试管稀释法1．原理将待测细菌种于一系列含有不同浓度抗菌药物的液体培养基中，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（minimalinhibitoryconcentration,MIC）或最低杀菌浓度（minimalbac