dns比色法测定还原糖和总糖

《dns比色法测定还原糖和总糖》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、还原糖和总糖的测定(3,5-二硝基水杨酸比色法)一、实验目的1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理2、学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类。单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，例如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用各种糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。对非还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成还原性单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(常以葡萄糖含量计)。还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕

2、红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以系数0.9。三、实验材料和试剂1、实验材料面粉2、实验试剂①1mg/ml葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。②3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂将6.3gDNS和262ml2MNaOH溶液，加到

3、500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。③碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中。④酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250ml70%乙醇中。⑤6MHCl和6MNaOH各100ml。四、实验器材具塞璃玻刻度试管：20ml×11大离心管：50ml×2烧杯：100ml×1三角瓶：100ml×1容量瓶：100ml×3刻度吸管：1ml×1；2ml×2；10ml×1恒温水浴锅沸水浴离心机扭力天平分光光度计五、操作步骤1、制作葡萄糖标准曲线取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为

4、1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。表1葡萄糖标准曲线制作管号1mg/ml葡萄糖标准液(ml)蒸馏水(ml)DNS(ml)葡萄糖含量(mg)光密度值(OD-540nm)0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min取出，冷却至室温，用蒸馏水补足至10ml，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，分别测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)

5、为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。2、样品中还原糖和总糖的测定①还原糖的提取准确称取3.00g食用面粉，放入100ml烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后补足至50ml蒸馏水，搅匀，置50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到50ml离心管中，于4,000r/min离心5min，沉淀可用20ml蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液收集在100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。②总糖的水解和提取准确称取1.00g食用面粉，放入100ml三角瓶中，加15ml蒸馏水及10ml6MHCl，置沸水浴中加热水解30min(用碘-碘化钾溶液检查水解是否

6、完全)。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6M/lNaOH中和至微红色(至中性)，用蒸馏水定容在100ml容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10ml，移入另一100ml容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。③显色和比色取4支具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表2样品还原糖测定管号还原糖待测液（mL）总糖待测液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）光密度值（OD-540nm）查曲线葡萄糖量（mg）70.51.51.580.51.51.59111.510111.5五、结果与计算

7、计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。查曲线所得葡萄糖毫克数×提取液总体积/测定时取用体积还原糖(%)=——————————————————————————×100样品毫克数查曲线所得水解后还原糖毫克数×稀释倍数总糖(%)=————————————————————×0.9×100样品毫克数六、