小鼠胚胎成纤维细胞制备

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1、小鼠胚胎成纤维细胞制备一．取得小鼠胚胎1.性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼。2.每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5d。3.取怀孕12.5～14.5d母鼠,断颈处死，无菌条件下暴露子宫。4.用镊子提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角。5.取出整个子宫,置于有PBS的平皿内。用PBS洗涤三次,弃除表面残余血迹。6.沿子宫系膜侧剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎,置于另一盛有PBS的平皿内,充分洗涤,弃除表面红细胞。7.用小

2、镊子撕破胎膜,取出胎鼠,弃除胎膜,用PBS洗涤三次。8.去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS的平皿内,用PBS至少洗涤三次,充分弃除红细胞。二．取得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）1.用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块,吸置于离心管内。2.加适量胰酶，将离心管置于培养箱中10-20分钟3.取出离心管，反复吹打，加足量培养液终止消化4.离心1000转，5分钟5.弃掉上清，加适量培养液，反复吹打20次6.分装到T75中，一般每2个胚胎可以制成一个T75的原代细胞7.

3、置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养8.待细胞长3-7天细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可1：3-1：6传代9.吸弃培养液上清10.PBS（不含钙镁）冲洗两次11.加0.25%胰酶-0.02EDT消化1.在显微镜下观察，当少量细胞漂浮，贴壁的细胞层出现裂隙时，用移液管吹打冲洗瓶底5-6次2.即刻加MEF培养液终止消化3.1000转，5分钟离心。吸弃上清4.加足培养液，吹打制成单细胞悬液，分装到各T75中。完成传代5.原代细胞中还有少量组织块未被充分消化，在以后的每次传代过程中要尽量制成单细胞悬液，组

4、织块会逐渐消失6.原代细胞中混有一些杂细胞，一般传到第3代时,杂细胞逐渐减少。小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时,细胞互相交联，形态不典型。三．MEF的冻存1.当细胞90%-100%融合时,尤其细胞少量堆聚可冷冻。2.处理方法同二的9－14，每75cm2的细胞加3ml冻存液重悬细胞。3.每个冻存管编号加1ml细胞悬液。4.置入程序降温盒-800C过夜，放入液氮长期保存。四．灭活MEF制备饲养层细胞1.取新的培养瓶，加0.1％Gelatin溶液覆盖预处理30分钟，用前吸掉Gelatin溶液。2.取需要处

5、理的MEF细胞，以10ug/ml浓度加丝裂霉素（MitomycinC）混匀。3.置培养箱中3小时。4.吸弃废液。5.用DPBS洗5遍。6.处理方法同二11－14。7.处理过的MEF加适量培养液重悬计数，以3.0×104/cm2（MEF）铺在Gelatin处理过的培养瓶上8.置培养箱中静置过夜，使其贴壁9.铺好的饲养层在1-7天内有效，都可以支持mES生长并维持其全能性