小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备.doc

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1、小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备北京大学工学院葛子钢实验室第一次撰写2008/12/05汪丽丽最后修改2009/06/29汪丽丽共3页目的培养MEF细胞做饲养层细胞，为胚胎干细胞的扩增提供环境条件。主要器材超净工作台上海力新实业有限，HFSsfe-1200CO2细胞培养箱SANYO，MCO-15AC-80℃超低温冰箱REVCO，LEGACI倒置相差显微镜Olympus，U-PMTUC数码照相机Olympus，C-3040ZOOM台式高速离心机Eppendorf，minispin液氮罐CBS各种规格培养板、培养皿Falcon细胞培养主要试剂1.小鼠胚胎成纤维细胞（M

2、EF）培养液DMEM/h（Hyclone,SH30022.01）85%；FBS（ Hyclone，30071.03 ）15%2.丝裂霉素C（Sigma,M4287）饲养层培养液溶解100µg/ml，分装，-20℃保存。3.Gelatin(Sigma,G2500)超纯水溶解，1g/L。高压灭菌后，4℃保存。4.0.25％trypsin＋EDTA(Hyclone,SH30042.01)0.25％trypsin：EDTA=1:15.小鼠胚胎成纤维细胞冻存液小鼠胚胎成纤维细胞培养液90%；DMSO(Sigma,D5879)10%；小鼠品系ICR小鼠孕鼠12.5~13.5

3、天实验步骤1.小鼠MEF的制备1．准备：洗净双手，穿好隔离服，戴好消毒的一次性口罩、帽子，戴上乳胶手套，喷洒酒精消毒。2.取材：⑴准备100mm培养皿一个，60mm培养皿两个，小滴管向三个培养皿中均加入PBS，小皿PBS量约4~5滴管，要求皿中PBS能浸泡之后所容组织即可。⑵脱颈处死孕12.5~13.5天的雌鼠：①捉小鼠尾巴，将小鼠取出笼子。②左手揪住尾巴，右手握住剪子用剪子上部按住颈部。③两手向两边用力拉伸，同时右手下压颈部。④腹部朝上喷洒酒精消毒。⑶镊子提起腹部下方的皮肤，剪开小口，向上撕开，镊子提起腹膜剪开腹腔，可见子宫中深红色胚胎连成串，从右侧剪下子宫韧

4、带，连同子宫一起取下，放入装有PBS的100mm培养皿中。⑷用眼科剪沿子宫纵轴剪开胚胎之间连接，使胚胎独立，剪开胎盘、剥去羊膜等胚胎外组织，PBS中洗净，将胚胎移至盛有PBS的60mm培养皿中。⑸记下胚胎数量，两个直头镊子去除胚胎头、内脏及四肢。3.清洗：将胚胎剩余部分移入盛有PBS的60mm培养皿中，浸泡洗净。4.消化：⑴将胚胎组织移入15ml离心管内，加5ml胰蛋白酶溶液，小滴管吹吸组织到尽量均匀、碎小。37℃温育15分钟，其间每隔5min用吸管吹吸组织均匀、碎小。⑵使消化液自行沉降，如仍有残渣，吸取上层溶液到灭菌容器，用两倍体积血清培养基中和胰酶活性，终止

5、消化。剩余残渣重复此消化过程，最终所有组织基本消化完全，溶液收集到一起。5.培养和传代：⑴用饲养层细胞培养液加入收集的溶液中，最终溶液体积为一个胚胎2~3皿，一个皿7~9ml。最初两天为防止污染，可于培养基中添加2倍量双抗PS，以后如不污染，可逐渐减少双抗使用直到不用。轻摇均匀后，吸入100mm培养皿中培养。⑵约2~3天后传代，90%汇合时1：3传代，此代细胞冻存，5代以内的细胞用作饲养层。6.冻存和复苏：细胞冻存：①大皿长满，一皿冻两管。②PBS洗3次，加入胰酶，37℃5分钟，加入含血清的培养液终止消化，低速离心洗涤，收集细胞。③加入冻存液，移入冻存管内，置于

6、冻存盒内，-80℃冰箱过夜，次日投入液氮。细胞复苏：①一冻存管复苏1个100mm培养皿，加入2~3ml饲养层细胞培养液到一离心管。②取出冻存管立即投入37℃水浴，反复摇至液体全部解冻，将细胞悬液移入离心管的培养基内，离心弃上清，加培养液重悬细胞，移至培养皿内，放入培养箱培养。③复苏细胞长满后用丝裂霉素C处理，传代到明胶培养皿中作饲养层细胞使用。2.丝裂霉素C处理MEF细胞MEF复苏培养3天，长满一个平皿，加入丝裂霉素C（10µg/ml），工作液孵育2小时后吸出，用PBS充分洗涤，作用是抑制细胞有丝分裂但不影响其活性，将灭活细胞直接使用或冻存备用。使用时，将0.1

7、%明胶溶液均匀铺满培养皿，室温静置2h，吸出明胶溶液，将灭活的MEF细胞约2x106个铺在明胶包被的培养皿上，饲养层细胞培养液继续培养备用。