基于直接标记法抗体微阵列的初步构建

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1、基于直接标记法抗体微阵列的初步构建作者：王丽梅，刘必成，吕林莉，郑敏【摘要】目的：初步构建基于直接标记法的抗体微阵列，并评价其应用于临床的可能性。方法：选择白蛋白作为目标蛋白，通过琼脂糖铺片、玻片活化、机器点样、点样后固定等步骤构建抗体微阵列，经封闭非特异位点、标记抗原、加样后对白蛋白进行检测，对关键步骤——抗原标记进行最佳条件摸索，通过对临床标本的检测评价其潜在应用价值。结果：应用BCA蛋白定量试剂盒测定尿液样本总蛋白浓度做出的标准曲线，其R2均大于0.99；温度为37℃时抗原标记效果最佳；标记后

2、抗原存放1周对信号的影响无统计学意义（P＜0.01）；本方法能够检测出临床检测为阴性的尿微量白蛋白浓度。结论:本研究构建了基于直接标记法的抗体微阵列，并对关键的抗原标记环节进行了最佳工作条件优化，有应用于临床检测的潜力。【关键词】抗体微阵列；直接标记法；BCA蛋白定量；蛋白标记抗体微阵列（antibodymicroarray,AbM）又称抗体芯片，是一种特殊的蛋白质芯片，芯片上固定抗体，通过特异性的免疫反应捕获待测样品中的抗原，从而实现高通量的免疫检测。AbM具有特异性和敏感性高（可达pg·ml-1

3、）、检测范围广（5～250000pg·12ml-1）、高通量、平行性完成样品的检测等优点。然而，要将其广泛应用于分析复杂样本中低丰度蛋白仍有很多关键性技术亟需解决［12］。基于直接标记的AbM，只需一个抗体即可实现靶蛋白的检测，有别于基于双抗体夹心免疫分析需要抗体对，容易实现多个目标因子检测AbM的构建。本研究旨在构建基于琼脂糖膜载体、直接标记免疫测定的AbM，通过孵育温度、保存时间探讨其关键步骤——抗原标记的最适反应条件，为进一步的技术完善和未来临床应用做准备。1材料与方法1.1试剂与仪器人血清

4、白蛋白（humanserumalbumin，HSA）和NHS生物素购自德国Merck公司，单克隆的抗人血清白蛋白抗体购自英国Abcam公司，蛋白定量试剂盒和蛋白酶抑制剂购自美国Pierce公司，链酶亲和素Cy3购自美国Zymed公司，小牛血清白蛋白（bovineseriumalbumin，BSA）和琼脂糖购自美国Sigma公司，MilliQ超纯水仪和超滤离心管购自美国Millipore公司；点样仪PixSys5500arrayer购自美国PackardBioscience公司，激光共聚焦芯片扫

5、描仪LuxScanTM10K(A)及图像分析软件SpotDataPro2.0均购自北京博奥公司。1.2方法121.2.1载体的制备制备琼脂糖膜玻片的过程如下：将未处理玻片浸入超纯水中12h以上，然后在超声清洗仪中以肥皂水清洗1h、超纯水清洗1h，最终烘箱烘干玻片以备用。超纯水配制0.5%的琼脂糖溶液100ml，充分混匀后置微波炉煮沸至溶液透明；取1.5ml溶液均匀铺至预热的洁净备用玻片上，室温凝固后置37℃烤箱烘干备用。1.2.2载体的活化将备用琼脂糖玻片置20mmol·L-1NaIO4溶液中，室

6、温下摇床慢摇活化30min，然后以0.01mmol·L-1pH7.4PBS洗涤5min×2次、超纯水洗涤5min×1次,氮气流吹干后即可进行下一步的点样［3］。1.2.3点样和固定抗HSA抗体经点样缓冲液（0.01mmol·L-1、pH7.4PBS溶液，甘油0.2L·L-1）按一定浓度梯度稀释，通过一定顺序置点样板孔。按预设阵列进行机器点样，点样后玻片置湿盒4℃12固定。每张玻片阵列设计根据实验需求而定，本实验每张玻片点12个相同的亚阵列，每个亚阵列中有5个样品，各样品重复点样4次。5个样品依次为3

7、个倍比稀释的抗HSA抗体（浓度依次为0.25、0.50、1.0mg·ml-1）、阴性控制（0.2mg·ml-1BSA）和阳性控制（一定浓度的链酶亲和素Cy3），见图1。1.2.4样本收集和处理尿液样本来源于东南大学附属中大医院内分泌科住院病人（临床诊断为糖尿病），留取标本时分两份，1份送医院临床检验中心，1份留作实验用。留取清晨中段尿，离心（3000r·min-1×10min）后取上清液，加入蛋白酶抑制剂和叠氮钠（每1ml上清液中加入10μl蛋白酶抑制剂和2μl叠氮钠），混匀后置-80℃冰箱保存以

8、备用。1.2.5蛋白质标记样本和白蛋白标准品均以NHS生物素进行标记，研究表明在AbM这一灵敏度很高的系统中生物素是复杂样本标记的理想选择［4］。首先，将保存于-80℃冰箱的尿液样本置室温下解冻，取适量应用BCA蛋白定量试剂盒严格按照使用说明书上的操作流程对样本中总蛋白的浓度进行测定；然后将样本（或标准品白蛋白）和NHS生物素按照质量比为2∶1进行混合，适当温度下孵育一定时间，比较反应温度0、4、25和37℃对信号值的影响。将标记混合物移至超滤离心管（0.5ml,