当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后pten的表达及统计分析

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1、当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后PTEN的表达及统计分析【摘要】目的：探讨当归注射液对缺血再灌注损伤心肌细胞PTEN的表达及统计学意义。方法:将35只SD大鼠随机分成4组(n=10):正常对照组(n=5);假手术组(n=10);缺血再灌注组(n=10);当归治疗组(n=10),建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色;观察各组动物心肌细胞内PTEN表达的变化。利用HPIAS2000图像分析系统测定PTEN在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组：心肌细胞内可见少量和未见棕黄色颗粒，PTEN表达呈阴性;假手术组：心

2、肌细胞内可见少量和未见棕黄色颗粒，PTEN表达呈阴性;缺血再灌注损伤组：心肌细胞内可见大量的棕黄色颗粒沉积，PTEN表达呈阳性;当归治疗组：心肌细胞内可见少量和未见棕黄色颗粒，PTEN表达呈阴性。图像分析结果显示：正常对照组、当归治疗组、假手术组与缺血再灌注损伤组之间PTEN表达的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01);正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间PTEN表达的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0.05)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤导致心肌细胞的凋亡有重要的保护作用。【关键词】当归注射液;缺血再灌注;心肌;

3、细胞凋亡;PTEN10　　心肌缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R),是指在短时间心肌血供中断,一定时间内恢复血供,原缺血心肌发生较血供恢复前更严重的损伤。随着心脏外科体外循环、冠状动脉搭桥术、复杂先天性心脏病纠治术、及溶栓等治疗的推广应用,已成为阻碍心血管治疗疗效的主要难题[1]。近年,中草药在心肌缺血再灌注损伤中的作用受到越来越多的关注,中草药舒张冠状血管、改善冠脉循环,减轻氧化损伤等均是其发挥心脏保护作用的重要机制[2]。　　当归为伞形科(Umbrelliferae)植物的干燥块根,药性甘、辛、温,入肝、心、脾经,具有补血活血、调经止痛、润燥滑肠

4、等功效[3，4]。当归属于和血类药物(指有养血、调和血脉作用的药物)。近年来，有不少学者对中药预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用进行了研究与探索。　　PTEN基因是迄今为止发现的第一个具有双特异性磷酸酶(DPS)活性的抑癌基因,该基因在细胞的生长、增殖、迁移和细胞凋亡中具有重要的生物学功能[5]。　　本实验采用免疫组织化学方法观察当归注射液对缺血/再灌注过程心肌细胞内PTEN的表达,探讨当归注射液对心肌缺血/再灌注损伤的作用机理。10　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1动物模型制备及分组选用健康雄性Wistar大鼠(SPF级)35只,体重250～300g左右。腹腔注射戊

5、巴比妥钠4.5mg·(100g)-1,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸[呼吸频率60次·min-1,潮气量2ml·(100g)-1],沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成4组:正常对照组(不做任何处理);假手术组(丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎);缺血再灌注损伤组(IR)(缺血/再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml/kg，结扎左冠状动脉前降支45min,再灌注120min);当归注射液预处理组(在结扎前20min，静脉注射当归注射液0.8ml/kg,其它处理同缺血/再灌注组)。　　1.2主要试剂

6、　　25%当归注射液(武汉大学中南医院制药厂);　　即用型兔抗鼠Bim多克隆抗体，即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸。以上试剂均购于北京中山生物技术有限公司。10　　1.3方法　　1.3.1常规HE染色取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色。　　1.3.2免疫组织化学SP法检测PTEN相关抗原主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，Ki67均采用高压抗原修复，正常羊血清处理10min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合

7、物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组。　　1.4免疫组织化学结果判断　　PTEN以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。　　采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对PTEN抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×10400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均