内皮抑素基因对鼠移植性肝癌抑制作用的实验性研究

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1、内皮抑素基因对鼠移植性肝癌抑制作用的实验性研究作者：王建立　李朝阳　孙学英　藏运金　沈中阳【摘要】　　目的：探讨血管内皮抑素endostatin对体内人肝癌细胞在体内的影响。方法：将以pcDNA3.1为载体的鼠源性endostatin基因转染人肝癌细胞SMMC7721建立的裸鼠的肝癌模型。应用免疫组化和Westernblot检测endostatin的转染和表达。用免疫组化计数肿瘤血管密度（MVD）和血管内皮生长因子（VEGF）的阳性率。同时观察转基因肿瘤的生长情况。结果：可见endostatin在肝癌细胞的稳定表达和分泌，其MVD显著低于对照组（P<0.05）,V

2、EGF同对照组比较差异亦有显著性（P<0.05）。结论：endostatin基因对人肝癌细胞SMMC7721在裸鼠体内的生长有显著的抑制作用，endostatin能减慢肿瘤生长速度，但不能完全消除肿瘤。【关键词】基因，endostatin　肝癌　体内转染　　Studyonendostatininhibitationofthegrowthoftransplantedhepaticcancerinnudemice【ABSTRACT】Objective:Toexploretheeffectofendostatin9onthegrowthofhumanlivercarci

3、nomainvivo.Methods:MiceendostatingenewastransferredintoSMMC7721cancerestablishedinnudemice.ImmunohistochemistryandWesternblotanalysiswereappliedtoexaminethetransfectionandexpression.Themicrovesseldesity(MVD),thepositiverateofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)werestudiedusingimmunohist

4、ochemicalmethods.Thegrowthofthecanceroftheendostatin-transfectedwereobserved.Results:ImmunohistochemistryandWesternblotprovedendostatinexpressionandsecretionfromendostatin-transfectedSMMC7721cells,comparedwithnegativecontrolgroup,MVDandVEGFwerelower(P<0.05).Conclusions:Endostatinmedia

5、tedbypcDNA3.1mightinhibitthegrowthofhumanhepaticcancerSMMC7721invivo.【KEYWORDS】Gene,endostatin·Hepaticcancer·Invivo9　　传统的肿瘤治疗手段主要针对增殖异常的肿瘤细胞，但不可避免的杀伤正常体细胞。20世纪70年代，美国学者Folkman提出了肿瘤生长依赖于血管的观点［1］，目前已证明肿瘤的生长及转移必须有新生血管的形成来维持。近年来，在肿瘤领域研究中已确立了肿瘤血管生成在肿瘤发展中的重要地位和肿瘤的抗血管生成疗法（antiangiogenicancerthe

6、rapy）的意义。本实验采用人肝癌细胞MMC7721建立裸鼠肝癌的皮下转移瘤模型，研究血管内皮抑素（endostatin）对肝癌生长的抑制作用，并探讨其对肝癌细胞凋亡的影响。1　材料和方法１．１　材料　4～5周龄裸小鼠（购自中国科学院上海实验动物中心），雌雄各半，在特异性无致病原菌条件下（specificpathogenfreecondition，SPE）饲养。人原发性肝癌细胞系SMMC7721购于中国科学院上海细胞生物学研究所。用含有10%小牛血清的RPMI1640（购于GIBCO公司）在37℃、5%CO2条件下培养。pcDNA3.1，endostatin/pcDNA

7、3.1由孙学英博士惠赠。限制性内切酶BamHⅠ，HindⅢ购自生物工程（大连）有限公司。质粒DNA小量纯化试剂盒（MiniBESTPlasmidPurificationKitVer2.0，50次量），购自生物工程（大连）有限公司。其他试剂包括：endostatin的抗体(Calbiochem-Novabiochem,LaJolla，CA)、兔多克隆VEGF抗体（LabVisionCorporation,CA,USA）、抗CD31抗体（Pharmingen，CA，USA）和二抗（VECTASTAINUniversaLQuickKit，Vec