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1、小鼠BCMA基因启动子活性研究【摘要】目的:探索B淋巴细胞成熟抗原（BCMA）基因5′上游序列的启动子活性,为进一步研究BCMA基因的表达调控机制提供实验依据。方法:构建由BCMA基因5′上游-820～+145、-607～+145、-359～+145、-157～+145、-93～+1455个片段驱动的荧光素酶报告载体pGL3B820、pGL3B607、pGL3B359、pGL3B157、pGL3B93,通过转染J558L、293T、HeLa细胞检测荧光素酶的表达,观察荧光素酶相对活性。结果:5种5′删除体的转录激活性由大到小为pGL3B157>pGL3B607
2、>pGL3B359>pGL3B93>pGL3B820。pGL3B157在3种细胞中的转录激活能力为J558L>HeLa>293T,且在J558L中的转录激活能力明显强于Hela和293T细胞。结论:BCMA基因5′上游序列“-820bp～+145bp”具有启动子活性,核心启动子可能位于-93～+145区域中。【关键词】BCMA启动子报告基因B淋巴细胞成熟抗原(Bcellmaturationantigen,BCMA)为B细胞表面分子,属于肿瘤坏死因子受体家族(TNFR),BCMA由184个氨基酸残基组成,其胞内部分由80个氨基酸残基构成,
3、BCMA的功能及作用机制迄今尚未阐明［1-3］。BCMA基因剔除小鼠有正常的脾结构,B细胞发育正常,T细胞非依赖性免疫反应和T依赖性免疫反应未见明显异常［4］,但浆细胞明显减少,证明BCMA在维持浆细胞的存1活中起了重要的作用。迄今对BCMA的研究主要集中于BCMA在B淋巴细胞发育中的作用,及BCMA蛋白质的功能分析,而对其自身的表达调控机制知之甚少,BCMA基因5′侧翼区基因组测序尚未完成,BCMA基因翻译起始位点前965bp5′侧翼区为未知序列。我们采用报告基因分析的方法,构建了由BCMA基因5′上游不同长度片段驱动的报告载体,通过转染不同细胞检测荧光素酶的表达
4、,初步探索了BCMA基因的5′上游序列启动子活性和BCMA启动子在不同细胞中活性的差异,为进一步寻找和定位BCMA5′上游序列内重要的顺式作用元件,研究BCMA基因的表达调控机制提供实验依据。1材料和方法1.1材料菌株JM109为本室保存,J558L购自上海午立生物有限公司,293T细胞购自中科院协和医学院细胞中心,HeLa细胞为本室保存。pGL3系列报告基因载体和pRLTK表达质粒均为Promega公司产品,pUCmT载体为上海博亚公司产品。KpnⅠ、XhoⅠ、T4DNA连接酶购自美国NEB公司,基因组抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自北京天为时代公司。DMEM
5、培养基、RPMI1640培养基购自Gibco公司,LipofactinamineTM2000购自美国Invitrogen公司,双荧光报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司,定点突变试剂盒购自美国Stratagene公司。电转仪为美国BioRad公司产品,TD20/21化学发光检测仪为美国Promega公司产品,ND100微量紫外分光光2度计为德国Nanodrop公司产品。J558L细胞采用RPMI1640培养液,293T和HeLa细胞采用DMEM培养液。1.2方法1.2.1小鼠BCMA基因片段的扩增、克隆及序列分析抽提小鼠骨髓瘤细胞J558L基因组,设计PCR
6、引物,上游引物含KpnⅠ酶切位点及保护碱基“GG”,下游引物位于翻译起始位点“ATG”前,含XhoⅠ酶切位点及保护碱基“CCG”。以J558L细胞基因组为模板,扩增BCMA基因上游序列-820～+145片段。引物在北京三博远志公司合成,设计如下:PB820F:5′GGGGTTCCGAGACAGGATCTTGCTGTG3′;PB820R:5′CCGCTCGAGGAGGGACTGGATCACTGAAA3′。PCR反应条件:95℃,5min;94℃,60s,→61℃,60s,→72℃,90s,30个循环;72℃,10min。970bpPCR产物经8g/L凝胶电泳回收并纯化
7、,TA克隆入pUCmT载体,转化大肠杆菌DH5α,挑出白色菌落,得到TB820,经KpnⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定,并于三博远志公司测序鉴定。1.2.2BCMA基因报告载体的构建及鉴定设计不同PCR上游引物,含KpnⅠ酶切位点及保护碱基“GG”。下游引物相同,位于翻译起始位点“ATG”前,含XhoⅠ酶切位点及保护碱基“CCG”,序列设计为BCMAR:5′CCGCTCGAGGAGGGACTGGATCACTGAAA3′。分别扩3增BCMA基因5′上游序列-820～+145、-607～+145、-359～+145、-157～+145、-93～+1455个片段。上游引物名称
